Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.La suddetta percentuale di manoscritti è stata respinta negli ultimi 12 mesi.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via e-mail.Torna a Diari » Progettazione, sviluppo e terapia di farmaci » Volume 12Autori Mu M, Zuo S, Wu RM, Deng KS, Lu S, Zhu JJ, Zou GL, Yang J, Cheng ML, Zhao XKPubblicato il 3 dicembre 2018 Volume 2018:12 Pagine 4107—4115DOI https://doi.org/10.2147/DDDT.S186726Revisione tramite revisione tra pari anonima singolaEditore che ha approvato la pubblicazione: Dr Anastasios LymperopoulosMao Mu,1,* Shi Zuo,2,* Rong-Min Wu,3 Kai-Sheng Deng,1 Shuang Lu,1 Juan-Juan Zhu,1 Gao-Liang Zou,1 Jing Yang,1 Ming-Liang Cheng,1 Xue-Ke Zhao1 1Dipartimento di Malattie Infettive, Ospedale Affiliato della Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou, Cina;2Dipartimento di Chirurgia Epatobiliare, Ospedale Affiliato della Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou, Cina;3Dipartimento di Ultrasonografia, The Maternity Hospital di Guizhou, Guiyang, Guizhou, Cina *Questi autori hanno contribuito in egual modo a questo lavoro Scopo: la fibrosi epatica è un problema sanitario mondiale.Lo sviluppo di nuovi farmaci efficaci per il trattamento di questa malattia è di grande importanza.Questo studio ha studiato gli effetti terapeutici dell'acido ferulico sulla fibrosi epatica in vitro e in vivo.Materiali e metodi: La linea cellulare stellata epatica umana (HSC) LX-2 è stata utilizzata per saggi in vitro.Il fattore di crescita trasformante β1 (TGF-β1) è stato utilizzato per indurre la fibrosi epatica nelle cellule LX-2.Western blot è stato utilizzato per rilevare i livelli proteici di collagene I, fibronectina, α-actina muscolare liscia (SMA), p-Smad2, p-Smad3, p-p38 e p-JNK.L'espressione genica è stata misurata mediante RT-qPCR.La colorazione a fluorescenza è stata utilizzata per determinare la localizzazione di Smad4.La fibrosi epatica indotta da CCl4 nei ratti SD è stata utilizzata come modello in vivo.Le caratteristiche istologiche sono state rilevate mediante colorazione con ematossilina ed eosina.I livelli di alanina aminotransferasi (ALT), aspartato aminotransferasi (AST), acido esadecenoico (HA) e idrossiprolina (Hyp) sono stati misurati mediante ELISA.Risultati: il trattamento con TGF-β1 ha aumentato significativamente i livelli di collagene I, fibronectina, α-SMA, p-Smad2, p-Smad3 e Smad4 nelle cellule LX-2.L'acido ferulico ha migliorato la fibrosi epatica indotta da TGF-β1 attraverso la regolazione della via TGF-β1/Smad.Coerentemente con i dati in vitro, CCl4 ha causato una grave fibrosi epatica nei ratti SD, come determinato dalla sovraregolazione di ALT, AST, HA e Hyp.I livelli proteici di p-Smad2 e p-Smad3 nei tessuti del fegato erano significativamente aumentati dopo il trattamento con CCl4.Tutti i cambiamenti indotti da CCL4 sono stati notevolmente attenuati dal trattamento con acido ferulico.Conclusione: l'acido ferulico ha migliorato notevolmente la fibrosi epatica attraverso l'inibizione della via TGF-β1/Smad in vitro e in vivo.Questi risultati hanno fornito prove per il potenziale uso dell'acido ferulico per trattare o prevenire la fibrosi epatica.Parole chiave: acido ferulico, TGF-β1, CCl4, fibrosi epatica, via di segnalazione Smad Corrigendum per questo articolo è stato pubblicatoLa fibrosi epatica è il risultato della guarigione della ferita dopo lesioni ripetute dovute a epatite cronica, colestasi, alcol o droghe.1 Nel fegato danneggiato, le cellule parenchimali si rigenerano e gli epatociti sono sostituiti da cellule degenerative.1 La fibrosi epatica rappresenta l'ultima via comune di tutte le malattie croniche del fegato e alla fine porta alla cirrosi, che è una malattia epatica allo stadio terminale.1Le cellule stellate epatiche (HSC) sono fattori chiave nello sviluppo della fibrosi epatica.Gli HSC sono normalmente quiescenti ma si attivano in risposta a danno epatico.Una volta attivate, le HSC diventano proliferative e fibrogene e accumulano la matrice extracellulare (ECM).2–4 Il fattore di crescita trasformante-β1 (TGF-β1) è un attivatore chiave delle HSC.Agisce in modo autocrino o paracrino ed è prodotto dalle cellule di Kupffer, dalle cellule endoteliali sinusoidali e dagli epatociti.5,6 Inoltre, il TGF-β1 sovraregola la sintesi delle proteine ​​associate all'ECM e dei recettori cellulari di diverse proteine ​​della matrice.5–7 Aumento dell'ECM l'espressione dei componenti, principalmente il collagene, è caratteristica della fibrosi epatica.Con la fibrosi epatica si verificano anche distruzione delle cellule parenchimali del fegato e cicatrici fibrose.8,9 Sebbene la fibrosi epatica sia reversibile,10 il conseguente danno strutturale ai lobuli epatici e alla vascolarizzazione porta alla cirrosi, che è irreversibile.Pertanto, la prevenzione e l'inversione della fibrosi epatica sono necessarie per il trattamento di varie malattie croniche del fegato e per prevenire la cirrosi.L'acido ferulico, un derivato dell'acido cinnamico, ha attività terapeutica contro una varietà di malattie.11,12 L'acido ferulico è anche un ingrediente efficace in alcune medicine tradizionali cinesi, come Angelica sinensis.12 Inoltre, l'acido ferulico può proteggere dall'endotelio vascolare disfunzione nei ratti diabetici quando combinato con astragaloside IV attraverso la regolazione della via del fattore nucleare-κB (NF-κB).12 Gli effetti antiossidanti dell'acido ferulico sono stati dimostrati anche in studi precedenti.12-14 Gli effetti epatoprotettivi dell'acido ferulico sono stati dimostrati in studi precedenti. studi che utilizzano diosbulbina B e tetracloruro di carbonio (CCl4) come iniziatori della fibrosi epatica.15-17Sebbene siano stati studiati i meccanismi protettivi dell'acido ferulico su molte malattie, pochi studi hanno studiato gli effetti dell'acido ferulico sulla fibrosi epatica.Degli studi effettuati, la maggior parte si è concentrata sulla capacità dell'acido ferulico di ridurre il danno ossidativo.Pertanto, nel presente studio sono stati studiati i meccanismi alla base degli effetti antifibrosi dell'acido ferulico.L'acido ferulico, il TGF-β1 e il CCl4 sono stati acquistati da Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, USA).Gli anticorpi anti-collagene I, anti-fibronectina, anti-α-SMA, anti-p-p38, anti-p-JNK, anti-p-Smad2 e anti-p-Smad3 sono stati tutti ottenuti da Cell Signaling Technologies (CST) .I kit commerciali utilizzati per misurare ALT, AST, HA e Hyp sono stati tutti acquistati dal Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Cina).Altri reagenti, come il Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), sono stati acquistati da Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA).Le HSC umane LX-2 sono state ottenute da Merck Millipore (Billerica, MA, USA) e sono state coltivate in DMEM integrato con siero fetale di vitello al 2% (FCS).Le cellule utilizzate negli esperimenti sono state sottoposte a non più di 10 passaggi cellulari;5 ng/mL TGF-β1 è stato utilizzato per indurre l'espressione del gene bersaglio in LX-2 HSC.Le cellule in crescita esponenziale sono state trattate con TGF-β1 per 24 ore.Il dimetilsolfossido (DMSO) è stato scelto come veicolo per dissolvere l'acido ferulico.La soluzione DMSO di acido ferulico è stata aggiunta al mezzo di coltura 12 ore prima dell'aggiunta di TGF-β1.Come controllo è stato utilizzato DMSO allo 0,5% (soluzione DMEM).Il test CCK-8 è stato utilizzato per misurare la vitalità cellulare LX-2.Le cellule sono state piastrate a 5 × 103 cellule per pozzetto in piastre da 96 pozzetti ed esposte a diverse concentrazioni di acido ferulico per 24 ore.Quindi, le cellule sono state incubate con 10 μL di CCK-8 per un'altra 1 ora a 37°C.Il prodotto risultante è stato misurato a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre (Thermo Fisher Scientific).4 × 104 cellule LX-2 HSC sono state piastrate su vetrini coprioggetto, poste in piastre a 6 pozzetti e incubate per 24 ore a 37°C.Le cellule sono state fissate in paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e permeabilizzate in citrato di sodio allo 0,1%/triton X-100 allo 0,1% per 15 minuti.Quindi le cellule sono state incubate con anticorpi primari contro Smad4 (Abcam, Cambridge, MA), USA a 4°C durante la notte.Gli anticorpi sono stati applicati in PBS contenente l'1% di albumina di siero bovino, seguiti da incubazione con anticorpi secondari (Thermo Fisher Scientific) per 1 ora a 37°C.I nuclei sono stati colorati con 4', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 15 minuti a 37°C.I tessuti o le cellule del fegato sono stati lisati con tampone RIPA contenente un cocktail di inibitore della proteasi.I lisati sono stati centrifugati a 10.000 g per 10 minuti a 4°C.Il supernatante è stato raccolto per ulteriori analisi.La proteina totale è stata misurata utilizzando il kit di analisi BCA (Pierce, Carlsbad, CA, USA).Uguali quantità di proteine ​​totali sono state caricate su un gel SDS-PAGE al 10% e trasferite su membrane di fluoruro di polivinilidene (PVDF) utilizzando un dispositivo di trasferimento a umido.Dopo il blocco con latte scremato al 5% a temperatura ambiente per 1 ora, le membrane sono state incubate con anticorpi primari per una notte a 4°C.Le membrane sono state quindi incubate con l'appropriato anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano per 2 ore a temperatura ambiente.Le membrane PVDF sono state incubate con reagente per elettrochemiluminescenza per visualizzare le bande.Gli anticorpi primari di collagene I, fibronectina, α-SMA, p-smad2, p-smad3, p-p38, p-JNK e β-actina sono stati forniti da Abcam.Tutti i valori sono stati normalizzati a β-actina.Tutti i campioni sono stati analizzati in triplicato.Il reagente Trizol (Thermo Fisher Scientific) è stato utilizzato per isolare l'RNA totale dalle cellule LX-2.Un kit di reazione a catena della polimerasi della trascrittasi inversa (RT-PCR) è stato utilizzato per la trascrizione inversa dell'RNA (2 μg) per ottenere il cDNA.Uno spettrofotometro NanoDrop 8.000 è stato utilizzato per quantificare l'RNA.Le procedure di ciclo della PCR erano le seguenti: 25°C per 5 minuti, 37°C per 60 minuti e 70°C per 5 minuti.In questo esperimento è stato utilizzato un sistema di rilevamento PCR in tempo reale 7500 di Thermo Fisher Scientific.I primer sono stati acquistati da Sangon Biotech (Shanghai, Cina).Collagene I: attaccante, 5′-TGGCCAAGAAGACATCCCTGAAGT-3′;retromarcia, 5′-ACATCAGGTTTCCACGTCTCACCA-3′.Fibronectina: attaccante, 5′-CCATCGCAA ACCGCTGCCAT-3′;retromarcia, 5′-AACACTTCTCTCAGCTATGGGCTT-3′.α-actina del muscolo liscio (α-SMA): in avanti, 5′-ACTGAGCGTGGCTATTCCTCCGTT-3′;retromarcia, 5′-GCAGTGGCCATCTCATTTCA-3′.GAPDH: attaccante, 5′-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC-3′;retromarcia, 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′.L'mRNA target è stato normalizzato a GAPDH.GAPDH fungeva da controllo endogeno.I cambiamenti di espressione relativa sono stati determinati utilizzando il metodo 2-ΔΔCt.Ratti Wistar maschi (180 ± 20 g) sono stati forniti da Vital River (Pechino, Cina).Gli animali sono stati divisi casualmente in quattro gruppi (sei ratti per gruppo): gruppo di controllo, CCl4, acido ferulico e acido ferulico + CCl4.Gli animali di tutti i gruppi hanno ricevuto una dieta commerciale standard per roditori e sono stati mantenuti su un ciclo luce/buio di 12 ore a temperatura e umidità costanti.Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Etico dell'Ospedale Affiliato alla Guizhou Medical University.Inoltre, è stata rigorosamente seguita la guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.I ratti nel gruppo CCl4 o nel gruppo acido ferulico+ CCl4 sono stati trattati per via intraperitoneale (ip) con CCl4 sciolto in olio d'oliva (20% v/v, 2 mL/kg) due volte a settimana per 8 settimane.Dopo questo ciclo di trattamento di 8 settimane, i ratti nel gruppo acido ferulico e nel gruppo acido ferulico + CCl4 sono stati trattati per via ip con 10 mg/kg di acido ferulico tre volte alla settimana per 8 settimane.Gli animali del gruppo di controllo sono stati trattati con soluzione fisiologica allo 0,9% tre volte a settimana per 8 settimane.Gli animali sono stati sacrificati 24 ore dopo l'ultima dose di acido ferulico o soluzione fisiologica allo 0,9% utilizzando CO2.Sono stati raccolti campioni di fegato e siero di ratto per analisi biochimiche e molecolari.Campioni di fegato di ratto sono stati conservati in una soluzione di paraformaldeide al 4% per ottenere fette istologiche.Dopo la fissazione, tutti i tessuti sono stati elaborati, i blocchi fissati con paraplasto sono stati sezionati (spessore 5 μm) e i vetrini colorati con ematossilina ed eosina (H&E).Microfotografie rappresentative sono state ottenute utilizzando un microscopio ottico (Nikon, Giappone).Rilevamento di ALT, AST, HA e HypI livelli sierici di aspartato aminotransferasi (AST) e aminotransferasi (ALT) nei ratti sono stati misurati utilizzando kit ELISA (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing China) secondo il protocollo del produttore.Una quantità adeguata di fegato è stata omogeneizzata in soluzione fisiologica allo 0,9%.La sospensione di omogeneizzazione salina allo 0,9% è stata utilizzata per analizzare HA e Hyp epatico utilizzando kit commerciali standard (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanchino, Cina) secondo le istruzioni del produttore.Tutti i valori sono presentati come media ± DS.Il test t di Student è stato utilizzato per confrontare i valori tra due gruppi.L'analisi ANOVA unidirezionale seguita dal test di Dunnett è stata utilizzata per confrontare i valori ottenuti da più gruppi.Le differenze sono state considerate statisticamente significative a P <0,05.L'espressione di collagene I, fibronectina e α-SMA è stata significativamente sovraregolata dal TGF-β1 nelle cellule LX-2Le cellule LX-2 sono state trattate con TGF-β1 per 24 ore e l'espressione genica di collagene I, fibronectina e α-SMA nelle cellule è stata misurata mediante RT-qPCR.Come mostrato nella Figura 1A, le espressioni geniche di collagene I, fibronectina e α-SMA sono state notevolmente aumentate dal TGF-β1 nelle cellule LX-2 rispetto al gruppo di controllo.Inoltre, queste tre proteine ​​sono state rilevate mediante Western blot.L'immagine originale e i risultati della quantificazione sono riassunti nella Figura 1B–F.Coerentemente con i dati RT-qPCR, le espressioni proteiche di collagene I, fibronectina e α-SMA in LX-2 HSC sono state significativamente aumentate dal TGF-β1.Tutti questi dati hanno indicato che il modello di fibrosi epatica in vitro è stato stabilito con successo.Figura 1 L'espressione di collagene I, fibronectina e α-SMA è stata significativamente sovraregolata dal TGF-β1 nelle cellule LX-2.Le cellule LX-2 a crescita esponenziale sono state trattate con 5 ng/mL di TGF-β1 per 24 ore.(A) La struttura chimica dell'acido ferulico.(B) I livelli di collagene I, fibronectina e α-SMA nel gruppo di controllo o TGF-β1 sono stati rilevati da RT-qPCR.(C) L'immagine rappresentativa della macchia occidentale di collagene I, fibronectina e α-SMA nel gruppo di controllo o nel gruppo TGF-β1.(D – F) La quantificazione delle espressioni delle proteine ​​​​di collagene I, fibronectina e α-SMA nelle cellule LX-2.Note: n=3 in ogni gruppo.**P<0,01 rispetto al gruppo di controllo.Abbreviazioni: α-SMA, α-actina del muscolo liscio;TGF-β1, trasformando il fattore di crescita-β1.L'acido ferulico ha migliorato la fibrosi epatica in vitro indotta da TGF-β1Successivamente abbiamo valutato gli effetti dell'acido ferulico sulla fibrosi epatica in vitro indotta da TGF-β1.La struttura chimica dell'acido ferulico è mostrata nella Figura 2A.I risultati di CCK-8 hanno indicato che l'acido ferulico 50 μM era citotossico per le cellule LX-2 (Figura 2B).Sulla base di questi dati, è stato utilizzato acido ferulico 30 μM per i successivi saggi in vitro.Come mostrato nella Figura 2C-F, la sovraregolazione di collagene I, fibronectina e α-SMA indotta da TGF-β1 è stata significativamente invertita dall'acido ferulico.Tuttavia, l'acido ferulico da solo non ha avuto alcun effetto su queste proteine.Questi risultati hanno suggerito che la fibrosi epatica indotta da TGF-β1 nelle cellule LX-2 potrebbe essere migliorata dall'acido ferulico.Figura 2 L'acido ferulico ha migliorato la fibrosi epatica in vitro indotta da TGF-β1.(A) Le cellule LX-2 sono state trattate con le concentrazioni indicate di acido ferulico per 24 ore e la vitalità cellulare è stata rilevata con il kit CCK-8.(B) Una densità di 5 × 103 cellule/pozzetto è stata piantata in una piastra da 96 pozzetti ed esposta ad acido ferulico per 12 ore prima del trattamento con TGF-β1.I livelli di collagene I, fibronectina e α-SMA nel controllo, TGF-β1, gruppo acido ferulico, TGF-β1 più gruppi di acido ferulico sono stati rilevati con RT-qPCR.(C) L'immagine rappresentativa di Western blot di collagene I, fibronectina e α-SMA nel gruppo di controllo, TGF-β1, acido ferulico o TGF-β1 più acido ferulico.(D – F) La quantificazione delle espressioni delle proteine ​​​​di collagene I, fibronectina e α-SMA nelle cellule LX-2.L'espressione genica relativa di GAPDH è stata utilizzata come standard interno nel test RT-qPCR.I risultati della quantificazione del Western blot sono stati normalizzati all'espressione della β-actina da Image Pro Plus.Note: n=3 in ogni gruppo.*P<0,05 rispetto al gruppo di controllo;**P<0,01 rispetto al gruppo di controllo, ##P<0,01 rispetto al gruppo TGF-β1.Abbreviazioni: α-SMA, α-actina del muscolo liscio;TGF-β1, trasformando il fattore di crescita-β1.Fibrosi epatica in vitro indotta da TGF-β1 indotta da acido ferulico attraverso l'inibizione della via TGF-β1/SmadSuccessivamente abbiamo studiato gli effetti dell'acido ferulico sulle vie TGF-β1/Smad, p38 e JNK nelle cellule LX-2.Come indicato nella Figura 3A-C, p-Smad2 e p-Smad3 sono stati significativamente aumentati dal trattamento con TGF-β1.Questi aumenti sono stati notevolmente attenuati dall'acido ferulico.Al contrario, le vie p38 e JNK non dovevano essere coinvolte nella fibrosi epatica in vitro indotta da TGF-β1 (Figura 3A, D ed E).Il solo acido ferulico ha avuto effetti limitati su queste proteine.Smad4 è tipicamente localizzato nel citoplasma.Dopo l'attivazione di Smad2 e Smad3, queste tre proteine ​​formano un complesso che si trasloca nel nucleo.Nel presente studio, Smad4 è stato localizzato principalmente nel citoplasma nei gruppi di controllo e acido ferulico.Tuttavia, TGF-β1 ha indotto significativamente la localizzazione di Smad4 nel nucleo.L'acido ferulico ha invertito la traslocazione nucleare Smad4 indotta da TGF-β1 (Figura 3F).Questi dati mostrano che l'acido ferulico ha attenuato la fibrosi epatica in vitro indotta da TGF-β1 attraverso l'inibizione della via TGF-β1/Smad.Figura 3 L'acido ferulico ha attenuato la fibrosi epatica indotta da TGF-β1 nelle cellule LX-2 tramite l'inibizione della via TGF-β1/Smad.(A) L'immagine rappresentativa della macchia occidentale di p-Smad2, p-Smad3, p-p38 e p-JNK in cellule LX-2 trattate con TGF-β1 e/o acido ferulico.(B–E) La quantificazione delle proteine ​​p-Smad2, p-Smad3, p-p38 e p-JNK nelle cellule LX-2 normalizzando l'espressione della β-actina con Image Pro Plus.(F) L'immagine rappresentativa della posizione cellulare di Smad4 in LX-2 mediante immunocitochimica e colorazione DAPI (ingrandimento × 200).Note: i nuclei sono stati colorati con DAPI per 15 minuti a 37°C;n=3 in ogni gruppo.**P<0,01 rispetto al gruppo di controllo, ##P<0,01 rispetto al gruppo TGF-β1.Abbreviazioni: DAPI, 4′, 6-diamidino-2-fenilindolo;TGF-β1, trasformando il fattore di crescita-β1.L'acido ferulico ha migliorato la fibrosi epatica di ratto indotta da CCl4 mediante l'inibizione della via SmadPer confermare ulteriormente gli effetti anti-fibrosi dell'acido ferulico, è stato stabilito un modello di fibrosi epatica di ratto in vivo utilizzando CCl4.Come mostrato nella Figura 4A, nel gruppo trattato con CCl4 sono state osservate infiltrazione di cellule infiammatorie, nuclei epatici frammentati e formazione di fibre collagene.Il danno causato da CCl4 è stato significativamente attenuato dall'acido ferulico, mentre l'acido ferulico da solo non ha influenzato questi marcatori biochimici.Inoltre, i livelli di ALT e AST nel plasma e HA e Hyp nei tessuti del fegato sono stati sovraregolati da CCl4 (Figura 4B-E).L'acido ferulico ha attenuato l'espressione di questi biomarcatori (Figura 4B-E).Coerentemente con i risultati in vitro, i livelli proteici di p-Smad2 e p-Smad3 sono stati significativamente sovraregolati da CCl4 nei tessuti del fegato, ma sono tornati alla normalità a seguito della somministrazione di acido ferulico (Figura 5A-C).Questi risultati hanno dimostrato che l'acido ferulico potrebbe migliorare la fibrosi epatica di ratto indotta da CCl4 mediante l'inibizione della via Smad (Figura 5D).Figura 4 L'acido ferulico ha migliorato la fibrosi epatica di ratto indotta da CCl4.(A) Le immagini H&E rappresentative del fegato in controllo, CCl4, acido ferulico o CCl4 più gruppi di acido ferulico.Le immagini sono state catturate al microscopio ottico con amplificazione 200 volte.(B-E) I sieri di ratto e i tessuti del fegato in ciascun gruppo sono stati raccolti alla fine dell'esperimento sugli animali.Note: I livelli di ALT, AST nei sieri e HA, Hyp nei tessuti epatici sono stati determinati utilizzando kit disponibili in commercio;n=6 in ogni gruppo.**P<0,01 rispetto al gruppo di controllo, #P<0,05, ##P<0,01 rispetto al gruppo CCl4.Abbreviazioni: ALT, alanina aminotransferasi;AST, aspartato aminotransferasi;HA, acido esadecenoico;H&E, ematossilina ed eosina;Hyp, idrossiprolina.Figura 5 Via Smad regolata dall'acido ferulico nel ratto trattato con CCl4.(A) L'immagine rappresentativa della macchia occidentale di p-Smad2 e p-Smad3 nei ratti trattati con CCl4 e/o gruppo di acido ferulico.(B, C) La quantificazione delle proteine ​​p-Smad2 e p-Smad3 nei tessuti del fegato normalizzandosi all'espressione della β-actina con Image Pro Plus;(D) Un diagramma di flusso per rappresentare la via molecolare regolata dall'acido ferulico nel ratto trattato con CCl4.Note: n=6 in ogni gruppo.**P<0,01 rispetto al gruppo di controllo, ##P<0,01 rispetto al gruppo CCl4.L'eccessivo accumulo di proteine ​​ECM, compreso il collagene, si verifica nella maggior parte dei tipi di malattie croniche del fegato e può indurre fibrosi epatica.18 Gli stadi avanzati della fibrosi epatica possono portare a cirrosi epatica e insufficienza.18 Nonostante una maggiore comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari alla base del fegato fibrosi, molte terapie antifibrotiche sono ancora allo studio.È stato riportato che l'acido ferulico, un acido fenolico, esercita effetti medicinali benefici.11,12 Tuttavia, pochi studi hanno esaminato l'effetto dell'acido ferulico sul danno epatocitario.Nel presente studio sono stati studiati i meccanismi alla base degli effetti antifibrotici dell'acido ferulico in vitro e in vivo.I risultati hanno indicato che l'espressione di α-SMA, un marker dell'attivazione delle HSC, era significativamente aumentata dal TGF-β1 esogeno.L'acido ferulico ha inibito l'aumento dell'α-SMA indotto dal TGF-β1, indicando che l'attivazione dell'HSC potrebbe essere prevenuta dall'acido ferulico.Inoltre, l'acido ferulico ha ridotto significativamente l'espressione della fibronectina nelle cellule LX-2 trattate con TGF-β1.Il TGF-β1, la principale isoforma del fattore di crescita trasformante, è implicato nella fibrosi epatica.5,6 Il TGF-β1 è legato a un peptide associato alla latenza ed è quindi mantenuto in uno stato inattivo.Una volta attivato, il TGF-β1 esercita le sue attività biologiche e patologiche attraverso le vie di segnalazione Smad.19 Le vie di trasduzione del segnale Smad mediano la sintesi del collagene indotta da TGF-β1 e svolgono un ruolo cruciale nello sviluppo della fibrosi epatica o nel recupero del fegato.19 Dopo la fosforilazione, il Il complesso Smad 2/3 si lega con Smad 4. Questo si trasloca nel nucleo per regolare l'espressione dei geni bersaglio.19 Per chiarire la relazione della segnalazione di TGF-β/Smad con la fibrosi epatica, i meccanismi mediante i quali l'acido ferulico ha attenuato il TGF-β1 indotto È stata studiata la fibrosi delle cellule LX-2.Il nostro studio ha mostrato che la fosforilazione di Smad 2/3 era sottoregolata dopo il trattamento con acido ferulico.L'acido ferulico ha ulteriormente inibito la traslocazione di Smad 4 nel nucleo.Questi risultati hanno indicato che l'inibizione della segnalazione di TGF-β/Smad può essere un meccanismo chiave mediante il quale l'acido ferulico esercita i suoi effetti antifibrotici sulle cellule LX-2 trattate con TGF-β1.CCl4 è stato ampiamente utilizzato come composto modello nei roditori per indurre danno epatico acuto, fibrosi epatica o cirrosi.20,21 Per esplorare ulteriormente gli effetti antifibrotici dell'acido ferulico, è stato stabilito un modello di fibrosi epatica di ratto indotto da CCl4 basato su il metodo di Domitrović e Jakovac.22 Nel nostro studio, l'analisi istologica ha mostrato che CCl4 causava necrosi delle cellule epatiche e accumulo di matrice di collagene con formazione di setti completi interconnessi, che dividevano il parenchima in frammenti separati nel fegato di ratto.Coerentemente con i dati in vitro, l'acido ferulico ha soppresso la fibrogenesi epatica riducendo lo spessore dei setti fibrotici a ponte.Questi risultati hanno suggerito che l'acido ferulico potrebbe ridurre le aree di fibrosi epatica.Inoltre, un'indicazione primaria del danno epatico indotto da CCl4 è stata ottenuta valutando i livelli di comuni marcatori enzimatici epatici di danno come AST e ALT.23 Dopo il trattamento con CCl4, i livelli di AST e ALT erano significativamente aumentati rispetto al gruppo di controllo. .Questi biomarcatori entrano nel sistema circolatorio a causa dell'alterata permeabilità delle membrane.L'aumento dei livelli di questi biomarcatori rifletteva un grave danno all'integrità strutturale del fegato.24,25 La somministrazione di acido ferulico ha attenuato significativamente l'aumento di AST e ALT indotto da CCl4, indicando la sua attività epatoprotettiva.Anche i livelli di HA e Hyp nel fegato sono indici importanti che riflettono il grado di fibrosi epatica.26 Nel nostro studio, i ratti trattati con CCl4 hanno mostrato livelli più elevati di HA e Hyp, con una marcata riduzione di questi marcatori dal trattamento con acido ferulico, suggerendo che l'acido ferulico il trattamento potrebbe attenuare la fibrosi epatica indotta da CCl4.Abbiamo dimostrato che l'acido ferulico è stato in grado di attenuare l'attivazione delle HSC indotte dal TGF-β1 inibendo la fosforilazione di Smad 2/3 e la successiva trasduzione del segnale di Smad 4.L'interruzione di questi percorsi ha contribuito all'inversione del processo fibrotico.Questi risultati hanno suggerito che l'acido ferulico può essere utile per fermare o invertire la progressione della fibrosi epatica e potrebbe essere utilizzato nello sviluppo di nuovi farmaci terapeutici per il trattamento delle malattie croniche del fegato.Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (concessione di numeri 81560104 e 81860115 a Xue-Ke Zhao).Gli autori non segnalano conflitti di interesse in questo lavoro.Friedman SL.Fibrosi epatica: dalla panca al capezzale.J Hepatol.2003;38(Suppl 1):S38–S53.Pinzani M, Marra F. 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