Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.La suddetta percentuale di manoscritti è stata respinta negli ultimi 12 mesi.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via e-mail.Torna a Diari » Progettazione, sviluppo e terapia di farmaci » Volume 9Autori Sun J, Fu X, Liu Y, Wang Y, Huo B, Guo Y, Gao X, Li W, Hu XPubblicato il 4 dicembre 2015 Volume 2015:9 Pagine 6327—6342DOI https://doi.org/10.2147/DDDT.S92777Revisione tramite revisione tra pari anonima singolaEditore che ha approvato la pubblicazione: Prof. Dr. Wei DuanJing Sun,1 Xueqi Fu,1–3 Ye Liu,1 Yongsen Wang,1 Bo Huo,1 Yidi Guo,1 Xuefeng Gao,1 Wannan Li,1–3,* Xin Hu1–3,* 1Scuola di Scienze della Vita, 2Key Laboratorio di Enzimologia Molecolare e Ingegneria del Ministero dell'Istruzione, 3Laboratorio Nazionale di Ingegneria del Vaccino contro l'AIDS, Scuola di Scienze della Vita, Università di Jilin, Changchun, Repubblica Popolare Cinese *Questi autori hanno contribuito in egual modo a questo lavoro Contesto: L'honokiol è uno dei principali costituenti bioattivi della tradizionale erba medicinale cinese corteccia di magnolia (Cortex Magnoliae officinalis, Hou Po).Lo scopo di questo studio era di sondare i suoi effetti anti-diabete mellito di tipo 2 e il meccanismo sottostante.Metodi: il modello murino diabetico di tipo 2 è stato stabilito mediante iniezione intraperitoneale di streptozotocina.Sono stati misurati la glicemia a digiuno, il peso corporeo e il profilo lipidico.Il tessuto adiposo sottocutaneo, il muscolo scheletrico e il fegato sono stati isolati e omogeneizzati.La subunità β del recettore della fosfo-insulina (IRβ), IRβ, fosfo-AKT, AKT, fosfo-ERK1/2, ERK1/2, fosfotirosina e actina sono state esaminate mediante saggio Western blot.La vitalità cellulare o la citotossicità è stata analizzata utilizzando il metodo MTT.Le potenze inibitorie dell'honokiol sull'attività della proteina tirosina fosfatasi 1B (PTP1B) sono state eseguite nel tampone di reazione.Sono stati inoltre analizzati l'aggancio molecolare e la simulazione dinamica.RISULTATI: In studi in vivo, il trattamento orale con 200 mg/kg di honokiol per 8 settimane riduce significativamente la glicemia a digiuno nei topi con diabete mellito di tipo 2.Le fosforilazioni dell'IRβ e dei fattori di segnalazione dell'insulina a valle, inclusi AKT ed ERK1/2, aumentano significativamente nel tessuto adiposo, del muscolo scheletrico e del fegato dei topi trattati con honokiol.Inoltre, l'honokiol ha migliorato le fosforilazioni stimolate dall'insulina di IRβ, AKT ed ERK1/2 in modo dose-dipendente nelle cellule miotubi C2C12.Nel frattempo, l'honokiol ha migliorato la traslocazione di GLUT4 stimolata dall'insulina.È importante sottolineare che l'honokiol ha mostrato un'attività inibitoria competitiva reversibile contro PTP1B con buona selettività in vitro e in vivo.Inoltre, utilizzando l'aggancio molecolare e gli approcci di simulazione dinamica, abbiamo determinato la potenziale modalità di legame di honokiol a PTP1B a livello atomico.Conclusione: questi risultati hanno indicato gli effetti ipoglicemici dell'honokiol e il suo meccanismo per cui l'honokiol ha migliorato la sensibilità all'insulina prendendo di mira PTP1B.Pertanto, il nostro studio potrebbe evidenziare l'honokiol come un promettente sensibilizzante dell'insulina per la terapia del diabete di tipo 2.Parole chiave: honokiol, T2DM, insulino sensibilizzatore, PTP1BSecondo gli ultimi dati dell'International Diabetes Federation, nel 2013 più di 382 milioni di persone soffrono di diabete ed entro il 2035 questo numero raggiungerà l'incredibile cifra di 592 milioni, causando 4,6 milioni di decessi ogni anno.1 Diabete mellito di tipo 2 (DM2T). ) è la forma più comune e rappresenta circa il 90% di tutto il diabete nel mondo.Il T2DM è riconosciuto come un gruppo di disordini metabolici, caratterizzati da iperglicemia, dislipidemia e insulino-resistenza nei suoi tessuti metabolici bersaglio.2,3L'insulina, come principale ormone che controlla la glicemia, agisce stimolando l'afflusso di glucosio e il metabolismo nei muscoli e negli adipociti e inibendo la gluconeogenesi nel fegato.4 In circostanze normali, l'insulina si lega alle subunità α del recettore eterotetramerico dell'insulina (IR) (α2 , β2), aumenta la flessibilità del ciclo di attivazione per consentire all'ATP di entrare nel sito catalitico e stabilizza il ciclo di attivazione nella conformazione attiva mediante autofosforilazione su più residui tirosilici,5 successivamente, evoca una cascata di eventi di fosforilazione.L'autofosforilazione migliora l'attività della chinasi IR e porta al reclutamento delle proteine ​​​​IRS, seguita dall'attivazione della fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K), AKT e, infine, la traslocazione GLUT4 e l'assorbimento del glucosio.4,6 La proteina tirosina fosfatasi 1B (PTP1B) defosforila l'IR attivato e IR substrato-1 (IRS-1), blocca la trasduzione del segnale dell'insulina, il che lo ha reso un regolatore negativo chiave nella via di segnalazione dell'insulina.7,8 Elchebly et al9 e Klaman et al10 hanno generato topi PTP1B-/- mediante un'interruzione mirata dell'ATG -codifica dell'esone e bersaglia gli esoni 5 e 6 (Ex5/6−/−), rispettivamente.Questi topi PTP1B−/− hanno mostrato una maggiore fosforilazione della tirosina di IR e IRS-1 nei muscoli e nel fegato come conseguenza dell'aumentata sensibilità all'insulina sistemica.9,10 Sulla base di questi risultati, PTP1B è considerato un bersaglio chiave per il diabete di tipo 2 .Sfortunatamente, è difficile sviluppare inibitori efficienti di piccole molecole di PTP1B.11L'honokiol, un composto bifenolico idrossilato (C18H18O2, peso molecolare = 266,33 kD) (Figura 1A), è uno dei principali costituenti bioattivi della corteccia di magnolia (la tradizionale droga a base di erbe cinese, Hou Po) con il contenuto dell'1%-5% in la corteccia essiccata naturalmente.12 Nel nostro studio precedente, abbiamo convalidato l'attività antidiabetica della corteccia di magnolia.13 L'honokiol si è dimostrato il componente farmacologicamente efficace12 con la potente attività di antiossidante, antinfiammatorio, antibatterico, antitumorale e ansiogeno antitrombotico.14 –17 Recentemente, Atanasov et al18 hanno dimostrato che l'honokiol funziona come un nuovo attivatore parziale di PPAR-γ non adipogenico in vitro.Choi et al19 hanno riferito che l'honokiol stimola l'assorbimento del glucosio attivando l'AKT dipendente da PI3K nei miotubi L6.Alonso-Castroa et al20 hanno dimostrato che l'honokiol stimola l'assorbimento del glucosio negli adipociti murini e umani.Tuttavia, pochi studi coinvolgono sia il suo effetto ipoglicemizzante in vivo che il meccanismo sottostante.Qui, abbiamo esplorato la potenza ipoglicemica e abbiamo compreso meglio i suoi meccanismi nel modello murino T2DM.Figura 1 Strutture chimiche di Honokiol e il suo effetto sulla vitalità delle cellule C2C12.Note: (A) Strutture chimiche di honokiol.(B) Citotossicità di honokiol nelle cellule C2C12.La vitalità delle cellule trattate con varie concentrazioni di honokiol per 24 ore è stata determinata mediante un test MTT.La vitalità delle cellule di controllo è stata rappresentata come 100%.I dati rappresentano la media ± SD (n = 3), *** P <0, 001 rispetto alle cellule di controllo.Abbreviazione: SD, deviazione standard.Honokiol è stato acquistato da Aladdin (Xi'an, Repubblica popolare cinese).La metformina è stata acquistata dal Grent Jilin Medicine Store (Changchun, Repubblica popolare cinese).Streptozotocina (STZ), albumina di siero bovino (BSA), Tris, p-nitrofenil fosfato (pNPP) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA).I kit per l'analisi dei trigliceridi totali (TG) e del colesterolo totale (TC) sono stati acquistati da Beijing BHKT (Pechino, Repubblica Popolare Cinese).Le membrane in polivinilidene fluoruro (PVDF) sono state acquistate da EMD Millipore (Billerica, MA, USA).I reagenti per l'elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) e gli esperimenti di immunoblotting sono stati acquistati da Sigma-Aldrich e l'apparato necessario da Bio-Rad Laboratories Inc. (Hercules, CA, USA).I mioblasti C2C12 sono stati ottenuti da KeyGEN Biotech e tutti i reagenti per colture cellulari provenivano da Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA).Proteine ​​ricombinanti contenenti i domini catalitici di PTP1B, proteina delle cellule T tirosina fosfatasi (TCPTP), Src homology 2 (SH2) contenente la tirosina fosfatasi 1 (SHP1), Src homology 2 (SH2) contenente la tirosina fosfatasi 2 (SHP2), e la proteina tirosina fosfatasi ematopoietica (HePTP) sono state purificate come descritto in precedenza (Figura S1).21–24Istituzione di un modello murino diabetico di tipo 2 e protocollo di trattamentoCinquantacinque topi cinesi Kunming maschi, di 8 settimane di età e di 18-22 g di peso (acquistati da Changchun Institute of Biological Products Co, Ltd., Pechino, Repubblica popolare cinese), sono stati utilizzati negli studi.Sono state seguite tutte le procedure di sperimentazione animale istituite dal Comitato etico per l'uso sperimentale degli animali e per la valutazione della sicurezza dei farmaci dell'Università di Jilin.Il presente studio e la sperimentazione animale sono stati approvati dal comitato etico dell'Università di Jilin, Changchun, Repubblica popolare cinese.Tutti i 55 topi sono stati alloggiati cinque in una gabbia in un ciclo luce/buio di 12:12 ore a temperatura ambiente di 22°C–25°C.Dieci topi sono stati nutriti con cibo normale come gruppo normale e gli altri 45 topi sono stati nutriti con una dieta ricca di grassi (composta da 20% di saccarosio, 10% di lardo di maiale, 2,5% di colesterolo, 1% di sodio colato e 66,5% di normale chow) per indurre il diabete di tipo 2.Dopo 4 settimane, 45 topi sono stati digiunati per 8 ore, ma hanno avuto libero accesso all'acqua, e quindi sono stati iniettati per via intraperitoneale STZ (35 mg/kg in 0,1 mol/L di soluzione fisiologica tamponata con citrato, pH 4,4; iniezione per 1 settimana e un tempo al giorno) per indurre il diabete di tipo 2.I topi indotti da STZ avevano libero accesso a cibo e acqua ricchi di grassi.Dopo 2 settimane, i topi indotti da STZ hanno mostrato una glicemia a digiuno (FBG) ≥11,1 mmol/L.Il loro TC nel siero è aumentato significativamente, ma il TG non è aumentato, confermando il successo dell'istituzione dei topi modello diabetici di tipo 2.Questi topi diabetici di tipo 2 sono stati separati in tre gruppi (dieci topi per gruppo), incluso il gruppo di controllo del diabete che ha ricevuto lo 0,9% di soluzione salina [veicolo], il gruppo honokiol ha ricevuto dosi di 200 mg/kg di honokiol (honokiol è stato sciolto nel dimetilsolfossido [DMSO] solvente e garantito la concentrazione finale a 200 mg/kg), il gruppo metformina ha ricevuto dosi di 200 mg/kg di metformina.Il gruppo normale ha ricevuto lo 0,9% di soluzione fisiologica (veicolo).Tutte le soluzioni madre del farmaco sono state diluite in soluzione fisiologica allo 0,9% e somministrate tramite sonda gastrica una volta al giorno per 8 settimane.Dobbiamo spiegare che la dose di honokiol utilizzata in questo è stata determinata dai pre-esperimenti.I nostri pre-esperimenti hanno progettato una serie di concentrazioni di honokiol (10, 50, 100, 150, 200, 250 e 300 mg/kg) e i risultati hanno mostrato che la concentrazione di 200 mg/kg svolge gli effetti ipoglicemizzanti più significativi (dati non mostrato).Pertanto, in questo studio, abbiamo selezionato 200 mg/kg come dose utilizzata in questo studio.Misurazione della glicemia a digiuno, del peso corporeo e del profilo lipidicoDurante il periodo di trattamento, il peso corporeo e la glicemia di topi a digiuno da 8 ore sono stati misurati ogni settimana.La FBG è stata misurata utilizzando un lettore di glucosio OneTouch UltraEasy.I campioni di sangue sono stati ottenuti dalla vena della coda dei topi.TG e TC totali nel siero sono stati misurati seguendo le istruzioni raccomandate nei kit commerciali.Alla fine della settimana 8 di trattamenti, i topi sono stati sacrificati dalla lussazione cervicale.Il tessuto adiposo sottocutaneo, il muscolo scheletrico e il fegato sono stati immediatamente sezionati e congelati in azoto liquido e quindi conservati a -80°C.I campioni di tessuto adiposo, muscolo scheletrico e fegato sono stati omogeneizzati in tampone di lisi ghiacciato (tampone campione in gel SDS senza blu di bromofenolo) e quindi centrifugati (12.000 × g, 20 minuti) a 4°C.Il supernatante è stato raccolto individualmente e le concentrazioni proteiche sono state misurate utilizzando i metodi Bradford.Per l'immunoblotting, il surnatante omogenato di fegato, muscoli e tessuto adiposo contenente 20 μg di proteine ​​​​è stato eseguito su SDS-PAGE (8% -10% di gel) e trasferito elettroforeticamente sulla membrana PVDF, separatamente.La membrana PVDF è stata quindi bloccata per 2 ore a temperatura ambiente con soluzione salina tamponata con tris con Tween (TBST) contenente il 3% di BSA.Le immunoblot sono state eseguite utilizzando anticorpi contro fosfo-IRβ (n. 3021, Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA), IRβ (n. 3025, Cell Signaling Technology, Inc.), fosfo-AKT (n. 4058, Cell Signaling Technology , Inc.), AKT (#9272, Cell Signaling Technology, Inc.), fosfo-ERK1/2 (sc-7383, Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA), ERK1/2 (bs-0022R, Pechino Biosintesi Biotechnology Co., Ltd., Pechino, Repubblica popolare cinese), fosfotirosina (sc-7020, Santa Cruz Biotechnology Inc.) e actina (TA-09, ZSGB-BIO, Pechino, Repubblica popolare cinese) incubazione per 12 ore durante la notte a 4°C, rispettivamente, seguiti da anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano per 2 ore a temperatura ambiente e visualizzati utilizzando il metodo della chemiluminescenza potenziata (ECL) e quantificati mediante scansione densitometrica con il software Quantity One.La coltura e la differenziazione dei mioblasti C2C12 sono state eseguite come precedentemente pubblicato.13 In breve, i mioblasti C2C12 sono stati coltivati ​​in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina (PS) a 37 °C in atmosfera umidificata con il 5% di CO2.Per la differenziazione, i mioblasti C2C12 sono stati coltivati ​​al 75% di confluenza in DMEM con 10% FBS, 1% PS.Quindi, le cellule sono state incubate in DMEM integrato con siero di cavallo al 2% e PS all'1% per 4-6 giorni per indurre i miotubi a maturare.Cellule di miotubi mature sono state incubate con varie concentrazioni di honokiol (sciolto in DMSO) per 1 ora e poi insulina 10 nM (sciolta in acqua sterile con pH 4,0) per 10 minuti.Le stimolazioni sono state interrotte da soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ghiacciata.Per raccogliere l'estrazione di cellule intere, le cellule sono state lisate con tampone di estrazione di cellule intere ghiacciate (25 mM β-glicerofosfato [pH 7,3], acido etilendiamminotetraacetico 5 mM, acido tetraacetico di glicole etilenico 2 mM, 5 mM β-mercaptoetanolo, 1% Tritone X-100, NaCl 0,1 M e una miscela di inibitori della proteasi).I lisati sono stati centrifugati a 12.000 × g per 20 minuti a 4°C, quindi i surnatanti sono stati raccolti individualmente.Per la frazione della membrana plasmatica, le cellule sono state raccolte secondo il kit di estrazione delle proteine ​​​​della membrana (BestBio, Pechino, Repubblica popolare cinese).Le concentrazioni proteiche sono state determinate mediante l'uso dei metodi Bradford.L'immunoblotting è stato eseguito come descritto in precedenza.25 In breve, le proteine ​​sono state separate su un gel di poliacrilammide SDS al 10% ed elettrotrasferite alla membrana PVDF seguita da immunoblot con anticorpi contro fosfo-IRβ, IRβ, fosfo-AKT, AKT, fosfo-ERK1/2, ERK1/2, GLUT4 (sc-1608, Santa Cruz Biotechnology Inc.), fosfotirosina e actina, rispettivamente.Le proteine ​​sono state visualizzate utilizzando il metodo ECL e visualizzate sul sistema di imaging chemiluminescente Tanon-5200 (Tanon Science & Technology Co., Ltd., Shanghai, Repubblica popolare cinese).Le cellule sono state piastrate su piastre da 96 pozzetti e trattate con concentrazioni variabili di honokiol per 24 ore.Quindi, il mezzo è stato rimosso e il mezzo fresco è stato aggiunto a ciascun pozzetto insieme a 10 mL di soluzione MTT (5 mg/mL).Dopo 4 ore di incubazione a 37°C, le cellule sono state lisate con 150 mL di DMSO e l'assorbanza del formazano viola è stata letta alla lunghezza d'onda di 490 nm utilizzando un lettore di micropiastre (BioTek, Winooski, VT, USA).Per ogni trattamento sono stati utilizzati sei pozzetti duplicati e gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte.Le potenze inibitorie di honokiol sull'attività PTP1B sono state eseguite in tampone di reazione, pH 7,0, contenente 50 mmol/L di acido 3-morfolinopropansolfonico (MOPS), 100 mmol/L NaCl, 1 mmol/L di acido etilendiamminotetraacetico, 1 mmol/L DL- ditiotreitolo (DTT) e 1 mg/mL di BSA, su una piastra da 96 pozzetti in volumi da 70 μL.Honokiol (10 μL) a varie concentrazioni è stato miscelato con una soluzione di PTP1B (10 μL) nel tampone per 5 minuti a 37°C.Quindi è stato aggiunto il substrato pNPP (10 μL, 100 mmol/L), incubando per 10 minuti a 37°C.I test sono stati terminati aggiungendo NaHCO3 (100 μL, 100 mmol/L).La quantità di p-nitrofenolo prodotto è stata misurata mediante assorbimento UV a una lunghezza d'onda di 405 nm con un lettore di micropiastre.I valori della metà della concentrazione inibitoria massima (IC50) sono stati ottenuti adattando le curve di inibizione dipendenti dalla concentrazione utilizzando il software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA), che può valutare la potenza inibitoria dell'inibitore.Per determinare il tipo di inibizione, ciascuna concentrazione di honokiol (0, 0,25, 0,5, 1 e 2 mmol/L) viene incubata con PTP1B in tampone di reazione per 5 minuti e le reazioni sono state avviate aggiungendo diverse concentrazioni di pNPP.Il tipo di inibizione è determinato secondo il grafico Lineweaver-Burk, 1/v contro 1/[S].La costante dell'inibitore (Ki) è stata calcolata in base al grafico, pendenza rispetto a [I].Nel rilevamento della selettività dell'honokiol nei confronti delle PTP, i sistemi di reazione si applicano a tutte le PTP incluso PTP1B.Tutti i punti dati sono stati effettuati in triplicato.Docking molecolare e simulazione dinamicaHonokiol (ZINCnum: 1536) è stato ancorato al sito attivo di PTP1B (PDBnum: 2VEV) utilizzando Autodock 4.0.26 Quindi, abbiamo eseguito una simulazione di dinamica molecolare di 100 ns per il complesso PTP1B-hon utilizzando la macchina di Groningen per il pacchetto di simulazione chimica (versione 4.5.5) con campo di forza ffG43a2 e modello ad acqua spc216.27–29 Le temperature sono state mantenute costanti a T=300 K accoppiando un termostato Berendsen con un tempo di accoppiamento di 0,1 ps.30 Le interazioni non legate sono state valutate utilizzando un intervallo gemello di cutoff da 8 a 14 Å.Per correggere le interazioni elettrostatiche, le interazioni oltre un limite di 14 Å sono state trascurate.Le distanze di legame e gli angoli di legame dell'acqua sono stati vincolati utilizzando l'algoritmo SETTLE.31 Le lunghezze di legame all'interno della proteina sono state vincolate con l'algoritmo LINCS.32I dati sono stati presentati come media ± DS.L'analisi statistica è stata condotta utilizzando il test t di Student o l'ANOVA unidirezionale con il software GraphPad Prism 5.Un valore di probabilità di P<0,05 è stato considerato statisticamente significativo.Honokiol riduce i livelli di glucosio nel sangue e migliora il disturbo del peso corporeo nei topi T2DMAll'inizio dello studio, abbiamo stabilito il modello murino T2DM mediante un'alimentazione ricca di grassi assistita da induzione di STZ a basse dosi.L'FBG dei topi ha raggiunto ≥11,1 mmol/L, il peso corporeo a digiuno e il TC erano significativamente più alti dopo l'induzione del T2DM rispetto a quelli prima dell'induzione, mentre il TG non è aumentato (Figura 2A).Questi risultati hanno confermato l'affermazione di successo del modello T2DM.Figura 2 Effetti antidiabetici di honokiol nei topi T2DM.Note: (A) Istituzione del modello di topi T2DM.Caratteristiche della glicemia a digiuno, peso corporeo, TC e TG nel modello di topi T2DM.I dati sono stati espressi come media ± DS (n=30).***P<0,001, NS: nessuna differenza significativa.(B) Potenza ipoglicemizzante di honokiol nei topi T2DM.Ai topi è stata somministrata per via orale soluzione fisiologica allo 0,9% da sola (veicolo), honokiol (200 mg/kg) o metformina (200 mg/kg) una volta al giorno per 8 settimane.I dati sono stati espressi come media ± DS (n = 8–10).++P<0,01 rispetto al gruppo honokiol (0 settimane), ****P<0,0001 rispetto al gruppo di controllo diabetico (8 settimane), #P<0,05 rispetto al gruppo metformina (0 settimane), ^^^^P<0,0001 rispetto al diabetico gruppo di controllo (8 settimane), NS: nessuna differenza significativa rispetto al gruppo metformina (8 settimane).(C) Potenza dell'honokiol sul miglioramento del disturbo del peso corporeo nei topi T2DM.I dati sono stati espressi come media ± DS (n = 8–10).****P<0,0001 rispetto al gruppo di controllo diabetico (8 settimane), ++P<0,01 rispetto al gruppo di controllo diabetico (8 settimane), NSa: nessuna differenza significativa rispetto al gruppo metformina (8 settimane), NSb: nessuna differenza significativa rispetto al normale gruppo (8 settimane), NSc: nessuna differenza significativa rispetto al gruppo normale (8 settimane).Abbreviazioni: TC, colesterolo totale;TG, trigliceridi;T2DM, diabete mellito di tipo 2;SD, deviazione standard.Abbiamo somministrato honokiol (200 mg/kg), metformina (200 mg/kg) o veicolo per 8 settimane a questi topi.L'FBG nei topi di controllo diabetici è aumentato gradualmente ed era significativamente superiore a quello dei topi normali (Figura 2B).I trattamenti giornalieri di honokiol e metformina hanno ridotto gradualmente i livelli di glucosio nel sangue nei topi diabetici (Figura 2B).Alla fine delle 8 settimane di trattamento, il livello di glucosio nel sangue nei topi trattati con honokiol era significativamente diminuito, rispetto ai topi di controllo diabetici e ai topi trattati con metformina senza alcuna differenza statisticamente significativa (Figura 2B).Questi risultati hanno delineato l'honokiol come un efficiente reagente ipoglicemico, sebbene siano necessari ulteriori esperimenti in vivo, in particolare con vari dosaggi, per stimare meglio il suo potenziale terapeutico.Il peso corporeo è diminuito rapidamente nei topi di controllo diabetici, mentre è diminuito all'inizio del trattamento e quindi è aumentato gradualmente nei topi trattati con honokiol (Figura 2C).I topi trattati con metformina e i topi normali hanno mostrato un peso corporeo stabile (Figura 2C).Il peso corporeo nei topi trattati con honokiol non ha mostrato differenze statisticamente alla fine del trattamento, rispetto ai topi normali e ai topi trattati con metformina (Figura 2C).Questi risultati suggeriscono che l'honokiol può migliorare il disturbo del peso corporeo nei topi T2DM.Caratteristiche del profilo lipidico nel sieroIl TC nel siero era significativamente più alto nei topi di controllo diabetici, rispetto a quello nei topi normali, mentre il TG nel siero è rimasto normale (Tabella 1).Non c'era alcuna differenza significativa nel TG e TC durante il trattamento con honokiol o metformina (Tabella 1).Questi risultati indicano che l'honokiol non influisce su TC e TG nei topi diabetici T2DM.Tabella 1 Caratteristiche del profilo lipidico nel siero Nota: i dati sono stati espressi come media ± DS (n=8–10).***P<0,001 rappresenta la differenza rispetto al gruppo Normale.Abbreviazioni: TC, colesterolo totale;TG, trigliceridi.Honokiol migliora la segnalazione dell'insulina nei topi T2DMPer affrontare il modo in cui l'honokiol ha il suo effetto sul miglioramento dell'iperglicemia nei topi T2DM, abbiamo studiato le vie di segnalazione dell'insulina nei tessuti bersaglio dell'insulina.Dato che la fosforilazione dell'IRβ è fondamentale per attivare le vie di segnalazione dell'insulina, abbiamo prima testato se l'honokiol migliora la fosforilazione dell'IRβ in vivo.Qui, troviamo che le fosforilazioni della tirosina nel tessuto adiposo, nel muscolo scheletrico e nel fegato dei topi trattati con 200 mg/kg di honokiol erano significativamente superiori a quelle dei topi di controllo diabetici, anche superiori a quelle dei topi normali, pur senza alterare il livelli proteici totali di IR (Figura 3A).Figura 3 Effetto dell'honokiol sulla segnalazione dell'insulina nei topi T2DM.Note: Effetto dell'honokiol sulla fosforilazione della tirosina di (A) IRβ, (B) AKT e (C) ERK nel tessuto adiposo, nel muscolo scheletrico e nel fegato.Le fosforilazioni della tirosina di IRβ, AKT ed ERK sono state determinate mediante Western blotting con anticorpi p-IRβ, p-AKT e p-ERK1/2 e sono state normalizzate rispettivamente con le proteine ​​IR, AKT ed ERK.Le fosforilazioni della tirosina di IRβ, AKT ed ERK nei topi normali sono state indicate come 100%.I dati sono stati espressi come media ± DS (n=3).**P<0,01, ***P<0,001 rispetto al gruppo di controllo diabetico, #P<0,05, ##P<0,01, ***P<0,001 rispetto al gruppo normale.Abbreviazioni: IR, recettore dell'insulina;T2DM, diabete mellito di tipo 2;SD, deviazione standard.Considerando il fatto che l'honokiol ha migliorato la fosforilazione della tirosina dell'IRβ in vivo, abbiamo quindi studiato il possibile effetto dell'honokiol sulla relativa segnalazione a valle.La segnalazione dell'insulina diverge principalmente dalla cascata MAPK, portando all'attivazione dell'espressione genica e della regolazione della crescita, e dalla via PI3K-AKT, che diverge ulteriormente dalla regolazione di diverse attività metaboliche come il metabolismo del glucosio (traslocazione GLUT4 e assorbimento del glucosio), nonché alla regolazione dell'espressione genica e della sopravvivenza.33 Coerentemente con i risultati di p-IRβ sopra, l'honokiol ha migliorato la fosforilazione della tirosina di ERK e la fosforilazione della serina di AKT nel tessuto adiposo, nel muscolo scheletrico e nel fegato dei topi T2DM, senza alterare i livelli proteici totali di ERK e AKT (Figura 3B).Pertanto, l'honokiol ha attivato il segnale prossimale dell'insulina e successivamente ha migliorato gli eventi di trasduzione a valle nei topi T2DM.L'effetto dell'honokiol sulla via metabolica PI3K-AKT è più rilevante per l'ipoglicemizzante dell'honokiol.Tuttavia, gli effetti dell'honokiol sulla cascata MAPK sono rimasti ulteriormente chiariti in studi futuri.Honokiol migliora la segnalazione dell'insulina nei miotubi C2C12Sulla base della scoperta che l'honokiol ha abbassato i livelli di glucosio nel sangue migliorando la segnalazione dell'insulina nei topi T2DM, abbiamo quindi esplorato se l'honokiol ha avuto i suoi effetti sulla via dell'insulina nei miotubi C2C12.La citotossicità dell'honokiol è stata testata utilizzando il test MTT e i risultati hanno presentato che l'honokiol senza citotossico al massimo delle concentrazioni era di 40 μM (Figura 1B).Pertanto, abbiamo determinato l'intervallo di concentrazione da 0 a 30 μM.Nel test, abbiamo prima confermato gli effetti dell'honokiol sulla sensibilità all'insulina nei miotubi C2C12.Qui, troviamo che, nelle cellule miotubi C2C12 trattate con insulina, l'honokiol ha ampiamente migliorato la fosforilazione della tirosina stimolata dall'insulina di IRβ in modo dose-dipendente, senza alterare i livelli proteici totali di IR (Figura 4A).Il miglioramento della fosforilazione della tirosina stimolata dall'insulina di IRβ da parte dell'honokiol ha rivelato la sua potente attività nel miglioramento della sensibilità all'insulina.Detto questo, esamineremo successivamente gli effetti di questo composto sulla via dell'insulina a valle.Come previsto, l'honokiol migliora la fosforilazione della serina di AKT- (Figura 4B) e la fosforilazione della tirosina stimolata dall'insulina di ERK (Figura 4C) in modo dose-dipendente, senza alterare i livelli proteici totali di IR e AKT.Questi risultati sono coerenti con i nostri risultati nei topi T2DM.Figura 4 Effetto dell'honokiol sulla segnalazione dell'insulina nei miotubi C2C12.Note: gli effetti dell'honokiol sulle fosforilazioni della tirosina di (A) IR, (B) AKT e (C) ERK sono stati determinati mediante Western blotting con anticorpi p-IRβ, p-AKT e p-ERK1/2 e sono stati normalizzati con Rispettivamente le proteine ​​IR, AKT ed ERK, che sono state poi calcolate come variazioni di piega della sola insulina.I dati sono presentati come media ± DS (n=3).*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 rispetto all'insulina da sola.(D) Effetto dell'honokiol sulla traslocazione di GLUT4.La frazione della membrana plasmatica (pm) e la proteina intera sono state sottoposte a Western blotting con l'anticorpo GLUT4.I dati sono presentati come media ± DS (n=3).*P<0,05, **P<0,01, rispetto alla sola insulina.Abbreviazioni: IR, recettore dell'insulina;SD, deviazione standard.Come riportato, GLUT4 è espresso principalmente nei muscoli e nei tessuti adiposi.34 In risposta all'insulina, la traslocazione di GLUT4 dal citoplasma alla membrana cellulare facilita il trasporto del glucosio, regolando così l'omeostasi del glucosio.Nella via dell'insulina a valle, AKT è fondamentale per la traslocazione di GLUT4.Dato che l'honokiol può migliorare la fosforilazione IR e AKT stimolata dall'insulina, abbiamo quindi esaminato se l'honokiol influisce sulla traslocazione di GLUT4 alla membrana plasmatica.Come indicato, l'honokiol ha aumentato in modo dose-dipendente il livello di GLUT4 indotto dall'insulina nella frazione della membrana plasmatica, mentre il livello di GLUT4 nei lisati cellulari interi non è stato alterato (Figura 4D).Pertanto, combinando i risultati precedenti sia nei topi T2DM che nei miotubi C2C12 che l'honokiol migliora la segnalazione dell'insulina, si suggerisce quindi che l'effetto ipoglicemico dell'honokiol sia attraverso la sua potente attività nel miglioramento della sensibilità all'insulina.Honokiol ha mostrato una potente attività inibitoria della PTP1BDato che l'honokiol può aumentare le fosforilazioni stimolate dall'insulina di IRβ, ERK e AKT e promuovere la traslocazione di GLUT4, si propone quindi che l'honokiol possibilmente mira a monte di ERK e AKT, che può anche modulare la fosforilazione di IRβ.Sapevamo che alcuni membri della famiglia di PTP come PTP1B possono defosforilare direttamente IRβ.35 Inoltre, cresce un notevole interesse per il potenziale di PTP1B come bersaglio terapeutico per il trattamento del diabete e dell'obesità in seguito alla delucidazione della sua importanza come regolatore delle vie di segnalazione dell'insulina e della leptina .36 Pertanto, PTP1B potrebbe essere uno dei primi candidati come bersaglio ad azione di honokiol.Nei nostri pre-esperimenti, sono stati stabiliti topi knockout del gene PTP1B (PTP1B-/-) ei risultati hanno indicato che il trattamento dell'honokiol non può influenzare la glicemia e il peso dei topi (Figura S2).Per confermare ulteriormente la nostra ipotesi, sono state rilevate l'attività inibitoria su PTP1B e la selettività contro PTP di honokiol.Secondo la curva inibitoria dipendente dalla concentrazione, il valore IC50 di honokiol è stato calcolato in 63,43 ± 1,07 μmol/L (Figura 5A).Per valutare la selettività dell'honokiol nei confronti delle PTP, sono state studiate le potenze inibitorie su un pannello di PTP, inclusi PTP1B, SHP1, SHP2, TCPTP e HePTP.I risultati sono stati elencati nella Tabella 2. Honokiol ha mostrato una modesta attività inibitoria contro SHP1, SHP2, TCPTP e HePTP, che era molto più debole rispetto a quella contro PTP1B (Tabella 2).Pertanto, l'honokiol ha mostrato una potente attività inibitoria di PTP1B e una buona selettività su PTP1B rispetto ad altri membri della famiglia di PTP.Al fine di determinare il tipo di inibizione dell'honokiol su PTP1B, è stata studiata l'analisi di Lineweaver-Burk.Il grafico Lineweaver-Burk ci ha fornito un'intercettazione comune di cinque linee sull'asse 1/v poiché la concentrazione di honokiol aumenta da 0 a 200 μmol/L, indicando che l'honokiol inibisce PTP1B competendo con il substrato per il sito attivo dell'enzima (Figura 5B) .Ki era la costante dell'inibitore di honokiol su PTP1B e Ki era determinato dall'intercetta sull'asse x, quindi il Ki è stato calcolato in 6,67 μmol/L (Figura 5C).Figura 5 Identificazione di honokiol come inibitore di PTP1B.Note: (A) curva inibitoria concentrazione-dipendente di honokiol contro PTP1B.I valori di IC50 sono stati utilizzati per valutare la potenza inibitoria.I dati sono stati espressi come media ± DS (n=3).(B) Il tipo di inibizione di honokiol contro PTP1B.Grafico di Lineweaver – Burk di 1/v (min·μM-1) rispetto a 1/[pNPP] (mM-1) a varie concentrazioni di honokiol.(C) L'inibitore costante (Ki) di honokiol contro PTP1B.(D) Evoluzione temporale dell'RMSD del complesso PTP1B-hon.(E) La struttura complessa dell'equilibrio di PTP1B e honokiol dopo MD, il ball-stick è stato mostrato come honokiol.(F) Modalità di legame di honokiol con la tasca del sito attivo di PTP1B.(G) Interazioni tra honokiol e residui nel sito attivo di PTP1B.Effetti dell'honokiol sulle fosforilazioni della tirosina delle proteine ​​nel tessuto adiposo (H), nel muscolo scheletrico (I) e nel fegato (J) dei topi T2DM e nelle cellule miotubi (K) C2C12.Le frecce indicano proteine ​​le cui fosforilazioni sono significativamente indotte dall'honokiol.Abbreviazioni: IC50, metà concentrazione inibitoria massima;PTP1B, proteina tirosina fosfatasi 1B;RMSD, deviazione quadratica media della radice;T2DM, diabete mellito di tipo 2;pNPP, p-nitrofenil fosfato;SD, deviazione standard;pY, fosfotirosina.Tabella 2 Selettività di honokiol rispetto a vari PTP Note: sono stati calcolati i valori IC50 di honokiol su vari PTP inclusi PTP1B, SHP1, SHP2, TCPTP e HePTP.I dati sono stati espressi come media ± DS (n=3).Abbreviazioni: HePTP, proteina tirosina fosfatasi ematopoietica;IC50, metà concentrazione inibitoria massima;PTP, proteina tirosina fosfatasi;PTP1B, proteina tirosina fosfatasi 1B;SD, deviazione standard;SHP1, Src omologia 2 tirosina fosfatasi 1 contenente il dominio;SHP2, Src omologia 2 fosfatasi tirosina 2 contenente il dominio;TCPTP, proteina delle cellule T tirosina fosfatasi.Inoltre, abbiamo anche studiato il controllo negativo e positivo nell'attività di PTP1B.In questo studio, abbiamo impiegato il noto inibitore PTP1B, Na3VO4, come controllo positivo e selezionato PBS come controllo negativo.I risultati hanno indicato che l'honokiol potrebbe inibire l'attività di PTP1B efficace quanto il Na3VO4 (Figura S3).Natura.Tutti i diritti riservati.