Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.La suddetta percentuale di manoscritti è stata respinta negli ultimi 12 mesi.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via e-mail.Torna a Diari » Rivista Internazionale di Nanomedicina » Volume 13Autori Yao H, Li J, Song Y, Zhao H, Wei Z, Li X, Jin Y, Yang B, Jiang JPubblicato il 9 ottobre 2018 Volume 2018:13 Pagine 6249—6264DOI https://doi.org/10.2147/IJN.S176176Revisione tramite revisione tra pari anonima singolaEditore che ha approvato la pubblicazione: Dr Linlin SunHua Yao, 1,* Jing Li, 1,* Yubin Song, 2 Hong Zhao, 1 Zhenhong Wei, 1 Xiuying Li, 1 Yongri Jin, 3 Bai Yang, 2 Jinlan Jiang 1 1Centro di ricerca scientifica, Ospedale dell'Unione Cina-Giappone di Jilin Università, Changchun, Jilin, PR Cina;2Laboratorio statale chiave di struttura e materiali supramolecolari, College of Chemistry, Jilin University, Changchun, Jilin, PR China;3College of Chemistry, Jilin University, Changchun, Jilin, PR China *Questi autori hanno contribuito in egual modo a questo lavoro Sfondo: i nanomateriali fluorescenti a base di carbonio hanno proprietà promettenti come il biorilevamento, l'imaging cellulare, il tracciamento e la somministrazione di farmaci.Tuttavia, i punti di carbonio (CD) con specifiche funzioni biologiche intrinseche non sono stati studiati.I ginsenosidi sono i componenti con molteplici bioattività presenti nelle piante del genere Panax, che hanno attirato molta attenzione per il loro effetto antitumorale.Materiali e metodi: in questo studio, abbiamo preparato una sorta di nuovi CD fotoluminescenti dal ginsenoside Re mediante il metodo di sintesi idrotermale in un passaggio.Per la caratterizzazione dei CD sono stati utilizzati i metodi convenzionali, tra cui la microscopia elettronica a trasmissione, la spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier, l'HPLC e lo spettro di fluorescenza.L'effetto antitumorale in vitro è stato studiato mediante test di citotossicità, citometria a flusso e analisi Western blot.Risultati: i Re-CD preparati avevano un diametro medio di 4,6±0,6 nm ed eccellenti proprietà luminescenti.L'assorbimento cellulare dei Re-CD è stato facilitato dalle loro minuscole dimensioni, con evidenza delle loro immagini fluorescenti luminose dipendenti dall'eccitazione.Rispetto al ginsenoside Re, i Re-CD hanno mostrato una maggiore efficienza di inibizione della proliferazione delle cellule tumorali, con una minore tossicità per le cellule normali.È stato suggerito che l'attività antitumorale dei Re-CD sia associata alla generazione di grandi quantità di ROS e all'apoptosi cellulare correlata alla caspasi-3.Conclusione: si spera che i doppi Re-CD funzionali, che potrebbero mostrare sia bioimaging che effetti antitumorali, dovrebbero avere un grande potenziale nelle future applicazioni cliniche.Parole chiave: punti di carbonio, ginsenoside Re, fluorescenza dipendente dall'eccitazione, imaging cellulare, attività antitumorale Corrigendum per questo articolo è stato pubblicatoI punti di carbonio (CD), inclusi i punti quantici di grafene e i punti polimerici, sono nanomateriali a base di carbonio a dimensione zero che hanno proprietà chimiche e fisiche interessanti.1–3 Come una sorta di materiale fluorescente, i CD hanno superiorità come un'eccellente fotostabilità senza scintillazione ottica , elevata resa quantica di fotoluminescenza (QY) e resistenza al fotosbiancamento.4–6 Inoltre, hanno una migliore biocompatibilità, una minore tossicità e rischi per l'ambiente rispetto ai nanomateriali di metalli pesanti, alla tombartite e ai punti quantici contenenti cadmio.7–10 A causa dei vari gruppi funzionali sulla superficie dei CD, mostrano un'idrofilia fine e possono anche essere facilmente modificati chimicamente.11,12 Tutti i caratteri importanti dei CD mostrano applicazioni promettenti nel biosensing, analisi delle sostanze, fotocatalisi, optoelettronica, somministrazione di farmaci, diagnosi in vivo, terapia, etichettatura fluorescente, bioimaging e così via.13–19I metodi di sintesi dei CD sono principalmente di due modalità: top-down e bottom-up.20–22 Si ritiene che i metodi di sintesi di carbonizzazione bottom-up, che sono rappresentati da calcinazione, pirolisi ad alta temperatura, microonde e sintesi idrotermale, abbiano evidenti vantaggi nella regolazione della composizione e delle proprietà fisiche dei CD selezionando attentamente le fonti precursori e le condizioni di carbonizzazione, rispetto ai metodi top-down.23,24 Quando si preparano i CD, fonti di carbonio organico come acido citrico, glicerolo, saccaridi, ammine, piante, succhi di frutta, biopolimeri a base di proteine ​​e così via sono ampiamente applicati a causa del basso costo, delle condizioni di reazione relativamente moderate e della compatibilità ambientale.25–29 La maggior parte dei CD riportati ha pregi di proprietà luminescenti e sono ampiamente utilizzati come nanocarrier di farmaci e reagenti per rilevamento di ioni o etichettatura biologica.Tuttavia, la maggior parte dei CD sintetici sono privi di attività biologiche stesse.Un aspetto è che le fonti di carbonio comuni selezionate per la sintesi dei CD non sono intrinsecamente bioattive.D'altra parte, durante il processo di trattamento per lungo tempo a temperature piuttosto elevate, la composizione e la struttura dei CD possono cambiare molto rispetto a quelle delle fonti di carbonio, quindi alcune delle bioattività possono scomparire e gli effetti possono essere persi.Recentemente, i ricercatori hanno scoperto che alcuni dei CD che utilizzano fonti di carbonio verde tra cui tè verde, aglio, pepe, lisina e così via o farmaci come l'aspirina possono ottenere sia caratteri fluorescenti che bioattività come effetti antitumorali, antiossidanti e antinfiammatori.30 –34 Questi interessanti CD possono mostrare bioattività significative quando vengono utilizzati per il tracciamento e la bioimmagine in vivo o in vitro.È una sfida affascinante formare i CD che hanno sia attività biologiche che proprietà fluorescenti dopo la sintesi idrotermale ad alta temperatura.Si spera che i CD con bioattività intrinseche possano essere utilizzati contemporaneamente sia per la diagnosi clinica che per il trattamento in futuro.I ginsenosidi sono composti farmacologicamente attivi di piante del genere Panax, come Panax ginseng CA Mey., Panax quiquefolium L. e Panax notoginseng (Burk.) FH Chen.35 Anni di ricerche hanno dimostrato che i ginsenosidi hanno effetti significativi sul sistema nervoso e protezione cardio-cerebrovascolare, immuno-potenziamento, antietà, antiossidante, antidiabete e effetti inibitori del cancro.36-39 Tra i >180 ginsenosidi identificati, alcuni dei principali come il ginsenoside Rb1, Rc, Rd, Re e così via hanno è stato dimostrato che ha molteplici attività farmacologiche, ma non mostra una significativa inibizione delle cellule tumorali.È stato confermato che i ginsenosidi rari come Rk3, Rh4, Rg5, Rg6, F4, Rg3, Rh2 e così via, che possono degradarsi dai principali mediante trattamenti termici e acidi o alcalini, hanno un effetto di inibizione del cancro estremamente elevato.40–43 Pertanto, ispirati dalla degradazione termica del ginsenoside Re che porta alla formazione di composizioni antitumorali Re-derivate, abbiamo selezionato Re come fonte di carbonio per ottenere CD funzionanti sia come reagenti di imaging che efficaci farmaci antitumorali attraverso il processo idrotermale.Durante la sintesi idrotermale dei CD a base di ginsenoside Re (Re-CD), i materiali originali verrebbero probabilmente distrutti e ricostruiti per formare nuovi costituenti e gruppi funzionali attivi.Inoltre, ginsenosidi rari derivati ​​dal ginsenoside Re, come Rg6, Rh1, Rk3 e protopanaxatriolo, potrebbero generare e combinarsi con Re-CD.Ciò potrebbe dare origine all'effetto antitumorale dei Re-CD preparati.In questo studio, abbiamo cercato di ottenere i Re-CD fluorescenti con il classico metodo di sintesi idrotermale.Le proprietà fisico-chimiche dei Re-CD preparati sono state caratterizzate da microscopia elettronica a trasmissione (TEM), spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier (FT-IR), microscopia confocale a scansione laser, spettrofotometria a fluorescenza e così via.I Re-CD ottenuti mostravano nanostrutture con una distribuzione di dimensioni ridotte a 4,6 nm e mostravano immagini fluorescenti stabili, luminose e multicolori sotto diverse irradiazioni di luce di eccitazione.L'attività antitumorale è stata dimostrata a livello cellulare e molecolare.I risultati interessanti hanno dimostrato che i Re-CD potrebbero inibire la proliferazione e indurre l'apoptosi di diverse linee cellulari tumorali e non hanno mostrato alcuna tossicità significativa per le cellule non cancerose.Quindi, i Re-CD con una buona biocompatibilità e solubilità potrebbero possibilmente ottenere doppie funzioni sia nel trattamento del cancro che nel bioimaging o tracciamento diretto.Le eccellenti caratteristiche renderebbero i Re-CD una nanomedicina sicura ed efficace che possiede un buon potenziale per le applicazioni nella terapia clinica.Poiché i ginsenosidi appartengono alle medicine tradizionali cinesi con elevati effetti farmacologici, questa ricerca intende anche fornire le basi teoriche per lo screening simultaneo di CD basati sulla medicina tradizionale cinese più fattibili con elevata intensità di fluorescenza e attività farmacologiche.Il ginsenoside Re (>98%) è stato ottenuto dal laboratorio di analisi farmaceutiche naturali (College of Chemistry, Jilin University) e identificato con lo standard mediante il metodo HPLC.44 Acido citrico anidro (CA, >99,5%; Aladdin Co., Shanghai, PR Cina) ed etilendiammina (EDA, >99,5%, grado analitico; Dow Chemical Company, Midland, MI, USA) sono state utilizzate anche in questo esperimento.Altre sostanze chimiche tra cui chinino solfato, cloruro di sodio, sodio dodecil solfato, tris(idrossimetil) aminometano (Tris) e persolfato di ammonio sono state acquistate da Sangon Biotech Co. (Shanghai, PR Cina).I solventi per HPLC come metanolo e acetonitrile sono stati acquistati da Sigma-Aldrich Co. Ltd (St Louis, MO, USA).DMEM, FBS e antibiotico-antimicotico sono stati ottenuti da Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA).La tripsina con lo 0,02% di EDTA è stata acquistata da Biosharp Company (Pechino, PR Cina).In questo studio è stata utilizzata acqua ultrapura (18,20 MU/cm) da un sistema ultrapuro Milli-Q.PBS (1×, 1 L, pH 7,4) che è stato prima equilibrato a 37°C per 30 minuti è stato utilizzato in questo esperimento.Poiché abbiamo cercato di preparare CD fluorescenti medicinali con contenuto di erbe ginsenoside Re, abbiamo prima preso in considerazione l'effetto farmaceutico.Quindi abbiamo ottimizzato le condizioni di sintesi, inclusa la temperatura idrotermale, il tempo di reazione e la purificazione.Per ottenere una fluorescenza molto forte per il bioimaging, abbiamo deciso di aggiungere una piccola quantità di CA e EDA per migliorare la proprietà fluorescente.Sulla base dei risultati mostrati in Figura S1 e della letteratura riportata,45,46 abbiamo finalmente confermato la procedura ottimizzata.In breve, 100 mg di ginsenoside Re sono stati aggiunti a 10 ml di acqua ultrapura.CA anidro (0,1 mmol, 19,21 mg) ed EDA (0,1 mmol, 6,01 mg) sono stati utilizzati in questo sistema per migliorare le proprietà luminescenti.Quando la soluzione miscelata è stata trasferita nel reattore di sintesi ermetico, la temperatura del sistema è stata fissata a 200°C per 10 ore.Dopo la reazione, il sistema è stato raffreddato naturalmente a temperatura ambiente e il liquido incolore è cambiato in marrone scuro.Quindi, la soluzione preparata è stata centrifugata per rimuovere le particelle agglomerate e filtrata attraverso una membrana da 0,22 μm prima della dialisi.Per un'ulteriore purificazione, i Re-CD sono stati dializzati in acqua ultrapura per 3 ore con sostituzione dell'ambiente di dialisi ogni ora, utilizzando la membrana di dialisi (cut-off del peso molecolare = 3,5 kDa, MD34-3500D; Solarbio Science & Technology Co., Pechino, Repubblica Popolare Cinese).Infine, i CD sono stati congelati ad essiccare con un liofilizzatore (Martin Christ Corporation, Osterode am Harz, Svizzera) e ridisciolti in PBS, quindi diluiti a diverse concentrazioni di lavoro nel mezzo di coltura.Per confronto, abbiamo anche preparato i CD che erano composti da CA ed EDA (1:1, rapporto molare) nelle stesse condizioni e purificati come menzionato prima.Prima di condurre misurazioni TEM, la soluzione Re-CDs originale preparata è stata diluita con acqua e depositata su griglie Cu rivestite con C da 400 mesh.Il solvente in eccesso è stato evaporato a temperatura ambiente.Quindi il test TEM è stato condotto utilizzando un microscopio elettronico Hitachi H-800 a una tensione di accelerazione di 200 kV con una fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica per registrare le dimensioni e la forma dei Re-CD.La spettroscopia FT-IR è stata eseguita per l'identificazione di legami chimici caratteristici e gruppi funzionali con uno spettrometro FT-IR tipo Nicolet AVATAR 360 di Thermo Fisher Scientific.Gli spettri di assorbimento ultravioletto (UV)-vis e fotoluminescente (PL) sono stati registrati dallo spettrometro Shimadzu 3100 UV-Vis (Shimadzu Co., Tokyo, Giappone) e dallo spettrofotometro a fluorescenza Shimadzu RF-5301-PC per caratterizzare le prestazioni fluorescenti dei CD in liquido, rispettivamente.30 La lunghezza d'onda di eccitazione degli spettri PL è stata operata in un intervallo da 320 a 540 nm.I valori QY di Re-CD e ginsenoside Re sono stati stimati a temperatura ambiente utilizzando solfato di chinino in una soluzione acquosa 0,1 mol/L di H2SO4 come riferimento.Al fine di ridurre al minimo gli effetti di riassorbimento, le soluzioni in cuvette da 10 mm sono state mantenute al di sotto di 0,1 alla lunghezza d'onda di eccitazione.Le larghezze delle fessure di eccitazione ed emissione sono state impostate a 5, 0 nm durante la registrazione degli spettri PL.34 La diffusione dinamica della luce (DLS) è stata registrata utilizzando l'analizzatore della dimensione delle particelle Nano-ZS 802DLS (Malvern Panalytical Ltd, Malvern, Regno Unito).Assorbimento cellulare di Re-CD e bioimagingLe cellule epiteliali renali umane 293T e le cellule epiteliali della mammella normale MCF-10A, nonché diverse linee cellulari tumorali MCF-7 (adenocarcinoma mammario umano), HepG2 (carcinoma epatocellulare del fegato) e A375 (melanoma maligno) sono state ottenute da American Type Culture Collection ( ATCC, Manassas, Virginia, USA).Le cellule epatiche umane normali HL-7702(L-02) sono state acquistate dalla banca cellulare dell'Accademia cinese delle scienze (Shanghai, Repubblica popolare cinese).I flbroblasti cutanei normali umani (NSFbs) sono stati separati da una persona sana e identificati da diverse caratterizzazioni fisiologiche.47 Tutte le linee cellulari tumorali e le cellule normali sono state coltivate in DMEM integrato con glucosio alto, FBS (10%) e antibiotico-antimicotico (1% ).L'incubazione è stata effettuata in atmosfera completamente umidificata a 37°C con il 5% di CO2.Prima del rilevamento, le cellule sono state seminate in piastre da 24 pozzetti con una densità cellulare iniziale di 5 × 104 cellule/pozzetto.Dopo 24 ore di incubazione, abbiamo rimosso il supernatante di coltura.Quindi, a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 500 μL di terreno di coltura mista con Re-CD a una concentrazione di 0,5 mg/mL.Dopo la coltura per 4 ore, le cellule aderenti sono state lavate tre volte con PBS e quindi fissate in formaldeide al 4% a temperatura ambiente per 30 minuti per analizzare l'imaging PL al microscopio a scansione laser confocale FLUOVIEW FV3000 (Olympus, Tokyo, Giappone).Il microscopio a fluorescenza invertita Leica DMI 3000B (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germania) è stato utilizzato anche per l'osservazione delle cellule.Le lunghezze d'onda di eccitazione sono state impostate nell'intervallo 510–530, 460–480 e 360–380 nm.Analisi HPLC della soluzione Re-CDHPLC è stato utilizzato per l'analisi qualitativa della soluzione Re-CD.Facendo riferimento a uno studio precedente,43 le condizioni dell'analisi HPLC erano le seguenti.In breve, per rilevare e analizzare i risultati è stato utilizzato il sistema HPLC Agilent serie 1200 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) dotato di una pompa quaternaria (G1311A), un vano colonna termostatato (G1316A) e un rivelatore UV (G1315A). .La colonna analitica era una colonna Agilent Eclipse XDB-C18 (4,6×250 mm, 5 μm).La temperatura della colonna è stata mantenuta a 30°C e la lunghezza d'onda di rilevamento è stata impostata a 203 nm.La fase mobile era costituita da acetonitrile (A) e acqua (B).Per rilevare il contenuto di ginsenosidi nella soluzione di Re-CD dopo il processo idrotermale, le condizioni di eluizione del gradiente di ginsenosidi rari sono state impostate come segue: 0–10 minuti, 29(A):71(B);10–25 minuti, 29(A):71(B)–40(A):60(B);25–50 minuti, 40(LA):60(B)–60(LA):40(B);50–60 minuti, 60(LA):40(B)–70(LA):30(B).La velocità di flusso di questo metodo era di 0,8 mL/min.Abbiamo anche rilevato la soluzione Re-CD mediante spettroscopia di massa HPLC (HPLC-MS).La MS è stata eseguita in modalità ioni negativi.La temperatura della sorgente di ionizzazione è stata impostata a 480°C.Il gas di tenda e il gas del nebulizzatore erano rispettivamente di 35 e 40 psi.La tensione di spruzzatura era di -4.500 V e la modalità del gas di collisione era alta.I campioni sono stati rilevati con un potenziale di declustering di -30 V e un potenziale di ingresso di -10 V per ottenere informazioni sugli ioni di frammento.I dati MS sono stati raccolti tra 200 e 1.700 m/z con un'energia di collisione di -10 V per l'analisi qualitativa.Test di vitalità cellulare (metodo Cell Counting Kit-8)La vitalità cellulare è stata rilevata utilizzando Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Kumamoto, Giappone).Rifletteva l'influenza dei CD e dei ginsenosidi preparati sulla proliferazione cellulare.In breve, le cellule epiteliali renali umane 293T e altre linee cellulari cancerose tra cui MCF-7, HepG2 e A375 sono state seminate in piastre da 96 pozzetti.Diverse concentrazioni di campioni sono state aggiunte nelle piastre e incubate per 24 ore.PBS e dimetilsolfossido servivano come controllo del solvente, se necessario.Dopo il trattamento, il mezzo di ciascun pozzetto è stato sostituito con uno fresco che conteneva il 10% di soluzione di CCK-8.Le piastre da 96 pozzetti sono state incubate continuamente a 37°C, 5% CO2 per 1 ora.Il danno cellulare potrebbe essere riflesso dal dosaggio dell'LDH rilasciato.Essendo un enzima citoplasmatico stabile presente in tutti i tipi di cellule, l'LDH viene rilasciato nel mezzo di coltura attraverso la membrana plasmatica danneggiata.La quantità del colorante formazano così formato è proporzionale alla quantità di LDH rilasciata nel surnatante cellulare, che indica l'integrità della membrana cellulare o citotossicità.Abbiamo utilizzato il kit di test di citotossicità LDH-WST dei laboratori Dojindo per eseguire questo rilevamento.In breve, le cellule tumorali in piastre da 96 pozzetti sono state incubate con diverse concentrazioni di Re-CD per 24 ore.Quindi 20 μL di Lysis Buffer sono stati aggiunti a ciascun pozzetto del controllo alto e quindi la piastra è stata incubata a 37°C per 30 minuti in un incubatore a CO2.Dopo aver centrifugato la piastra a 250 × g per 3 minuti per far precipitare le cellule, 100 μL del surnatante sono stati trasferiti da ciascun pozzetto a una nuova piastra trasparente da 96 pozzetti e 100 μL della soluzione di lavoro sono stati aggiunti a ciascun pozzetto.Dopo aver incubato al buio a temperatura ambiente per 30 minuti, a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 50 μL della soluzione di arresto.Quindi, l'assorbanza è stata misurata a 490 nm da un lettore di micropiastre.Il livello di ROS delle cellule A375 è stato rilevato da un citometro a flusso, che è stato utilizzato per l'analisi cellulare (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, USA).In breve, la sospensione cellulare con la concentrazione di 2,5 × 105 cellule/mL è stata seminata in piastre a sei pozzetti.Re-CD con diverse concentrazioni sono stati incubati con cellule per 24 ore.Quindi le cellule sono state raccolte e i ROS sono stati rilevati con un kit fluorescente di 2',7'-diclorodiidrofluoresceina diacetato (Beyotime Biotechnology, Jiangsu, PR China).Le sonde di rilevamento del 2',7'-diclorodiidrofluoresceina diacetato sono state aggiunte separatamente ai campioni e incubate per 30 minuti a 37°C in un luogo buio.Quindi abbiamo lavato i campioni con un mezzo privo di siero tre volte per rimuovere le sonde di rilevamento eccessive e abbiamo misurato la generazione di ROS mediante citometria a flusso.Analisi di imaging ad alto contenuto sull'apoptosi e la necrosi cellulareLe cellule tumorali in fase di crescita logaritmica sono state trattate con diverse concentrazioni di Re-CD in piastre da 96 pozzetti per 24 ore.Quindi, è stata intrapresa un'analisi di imaging cellulare ad alto contenuto per riflettere visivamente l'effetto antitumorale dei Re-CD.Nell'esperimento è stato utilizzato un kit di test di apoptosi e necrosi (Beyotime Biotechnology) e il test di colorazione è stato eseguito come segue.Le cellule sono state seminate in una piastra da 96 pozzetti e trattate con diverse concentrazioni di Re-CD.Dopo 24 ore di incubazione, il surnatante è stato rimosso e le cellule sono state lavate con PBS freddo.Le cellule tumorali sono state etichettate con Hoechst 33342 e ioduro di propidio (PI) per 30 minuti a 4°C sotto concentrazione di lavoro.Le cellule sono state lavate con PBS tre volte per rimuovere i liquidi coloranti ridondanti.Le immagini sono state ottenute con il sistema di analisi di imaging cellulare ad alto contenuto Operetta CLS™ (PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA).La lente dell'obiettivo 20× è stata applicata in ogni condizione di trattamento.I risultati sono stati rappresentati da oltre 40 campi per piastra, portando a campi complessivamente acquisiti per ciascuna condizione.Mentre cercavamo di studiare l'effetto dei ROS sull'apoptosi, i gruppi trattati con N-acetil-L-cisteina (NAC) e Re-CD sono stati presi come confronto.Rilevazione dell'apoptosi mediante Western blotLa caspasi-3 è una proteina indicatrice attivata nel processo di apoptosi.Per gli studi in vitro, l'attività della caspasi-3 è stata determinata mediante Western blot.In breve, le cellule tumorali trattate con diverse concentrazioni di Re-CD sono state lisate in tampone di lisi RIPA (Beyotime Biotechnology).La proteina totale di ciascun campione è stata estratta e rilevata con il metodo Bradford utilizzando il saggio proteico Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA).Uguali quantità di proteine ​​sono state caricate e separate da SDS-PAGE al 12% e trasferite su membrane di polivinilidene difluoruro (Sigma Aldrich Chemie Gmbh, Monaco, Germania).Dopo il blocco con il 5% di latte scremato, le membrane sono state incubate con anticorpi primari contro la caspasi-3 (1:1.000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) per una notte a 4°C.Dopo il lavaggio con TBS-T tre volte, l'anticorpo secondario marcato con fluorescenza Alexa Fluor® Plus 488 (Thermo Fisher Scientific) è stato ulteriormente incubato;la banda proteica è stata visualizzata dal sistema di imaging a infrarossi Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).La β-actina (1:5.000; Proteintech Group Inc., Rosemont, IL, USA) è stata utilizzata come carico interno per normalizzare i modelli di espressione di ciascun campione.I valori della scala di grigi dei campioni sono stati misurati dal software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).Sono stati eseguiti tre esperimenti separati per mostrare l'espressione della proteina.Per le risposte continue, i dati sono stati espressi come media ± DS sulla base di osservazioni triplicate da tre esperimenti indipendenti.La significatività statistica è stata determinata mediante ANOVA unidirezionale seguito da test di confronto multiplo di Tukey-Kramer.Il valore di P<0,05 è stato considerato statisticamente significativo.Tutte le analisi sono state condotte utilizzando il software SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).In questa indagine, i Re-CD sono stati sintetizzati da una strategia idrotermale in una fase attraverso la condensazione di ginsenoside Re, CA ed EDA.CA ed EDA hanno aiutato il ginsenoside Re a risolversi in acqua e ottenere proprietà luminescenti superiori (Figura 1A).L'immagine TEM dei Re-CD (Figura 1B) ha rivelato che i Re-CD erano punti sferici che avevano nanostrutture di dimensioni uniformi ed erano ben dispersi nell'acqua.La maggior parte dei Re-CD aveva diametri compresi tra 2,8 e 5,6 nm (Figura 1C).In base al conteggio e al calcolo di una certa quantità di Re-CD, abbiamo determinato che il diametro medio dei CD era 4,6 ± 0,6 nm.Abbiamo anche ottenuto lo spettro DLS dei Re-CD.I risultati hanno mostrato che i Re-CD avevano un diametro di circa 100 nm di distribuzione delle dimensioni delle particelle in soluzione (nella Figura S2).Figura 1 Illustrazione schematica dei CD Re-based tramite il metodo idrotermale (A) e l'immagine TEM (B) con la distribuzione delle dimensioni (C) dei Re-CD.Abbreviazioni: CA, acido citrico;EDA, etilendiammina;Re-CD, punti di carbonio Re-based;TEM, microscopia elettronica a trasmissione.Gli spettri FT-IR sono stati adottati per analizzare ulteriormente la struttura chimica dei Re-CD (Figura 2).I dati hanno illustrato che lo spettro FT-IR del ginsenoside Re mostrava una vibrazione di allungamento dell'idrossile alcolico (R-OH) a 3.382 cm–1.Un picco caratteristico a 1.312 cm–1 ha mostrato la vibrazione di flessione di C-H nella struttura dell'alchene insaturo (C = C).Inoltre, secondo un precedente rapporto,48 i picchi caratteristici del ginsenoside Re a 1.384 e 1.069 cm–1 appartenevano alla vibrazione di allungamento asimmetrico e simmetrico della struttura C-O-C.Rispetto al ginsenoside Re, i picchi a 2.960 e 1.375 cm–1 di Re-CD nella Figura 2A appartenevano rispettivamente alla vibrazione di allungamento asimmetrico e alla vibrazione di flessione simmetrica del gruppo metilico.Inoltre, sia il ginsenoside Re che il Re-CD hanno mostrato i caratteristici picchi di vibrazione di allungamento del metilene (−CH2−) rispettivamente a 2.933, 2.924 e 2.854 cm–1.In entrambi gli spettri, i picchi a 1.455 e 1.261 cm–1 indicavano rispettivamente la vibrazione di flessione C-H di strutture di alcani saturati (come -CH3 o -CH2-) e quella della vibrazione di allungamento C-O.Ma il picco di Re-CD a 1.261 cm–1 era più nitido di quello del ginsenoside originale.Il picco a 1.676 cm–1 di Re-CD era caratteristico della vibrazione di allungamento del legame insaturo (C=C o C=O).Inoltre, il picco a 1.594 cm–1 mostrava probabilmente la vibrazione di flessione di N–H.Lo spettro dei Re-CD aveva anche picchi di accoppiamento vibrazionale a 1.084 e 1.027 cm–1, che erano diversi da quelli mostrati nella Figura 2B.Ha indicato che c'erano gruppi funzionali con posizione e frequenza di vibrazione simili nel prodotto sintetico.Il nuovo picco acuto che è apparso a 802 cm–1 può essere assegnato alla vibrazione di flessione fuori piano di N-H.Avevamo anche preparato i CD senza ginsenoside Re, che sono stati sintetizzati solo da una miscela di CA ed EDA.Lo spettro FT-IR è stato mostrato nella Figura S3.Nell'analisi FT-IR dei CD, è stato osservato quanto segue: la vibrazione di allungamento di C−OH era di circa 3.500 cm–1, la vibrazione di allungamento asimmetrico di C−NH−C era di 1.130 cm–1, la vibrazione di flessione di N–H era a 1.570 cm–1 e la banda di assorbimento vibrazionale di C=O era a 1.675 cm–1.I risultati FT-IR hanno dimostrato che i Re-CD avevano i gruppi funzionali caratteristici del ginsenoside, così come i CD preparati da CA e EDA.Quindi, abbiamo ipotizzato che il ginsenoside Re si combinasse con EDA e CA per formare Re-CD.Inoltre, c'erano ancora strutture di ginsenoside e molti rimanevano o erano gruppi funzionali di nuova formazione sulla superficie dei Re-CD, che erano probabilmente attribuiti alla bioattività antitumorale.Figura 2 Gli spettri FT-IR dei (A) Re-CD preparati e (B) ginsenoside Re.Abbreviazioni: FT-IR, infrarosso a trasformata di Fourier;Re-CD, punti di carbonio Re-based.Proprietà fluorescenti e imaging cellulare di Re-CD in vitroLe proprietà fluorescenti e le prestazioni di bioimaging dei Re-CD nelle cellule tumorali A375 sono mostrate nella Figura 3. Secondo lo spettro di assorbimento UV-vis, il picco di assorbimento massimo era a 350 nm e c'era un picco piatto a circa 460 nm.Il QY di Re-CD è stato calcolato in 15,4% utilizzando solfato di chinino in una soluzione acquosa 0,1 mol/L di H2SO4 come riferimento alla lunghezza d'onda di eccitazione di 360 nm.Si pensava che gli indici di rifrazione dei due tipi di soluzioni confrontati fossero gli stessi, riferendosi a precedenti rapporti.30,46,49 Non c'era quasi nessuna fluorescenza del composto originale ginsenoside Re nelle stesse condizioni.La Figura 3B mostra gli spettri di emissione di fluorescenza dei Re-CD.I risultati hanno mostrato che i Re-CD mostravano un comportamento PL dipendente dall'eccitazione quando eccitati a lunghezze d'onda comprese tra 320 e 540 nm.La forte intensità PL dei Re-CD preparati si è verificata a 360 e 460 nm.È stato suggerito che le proprietà fluorescenti dei Re-CD derivino dalla ricombinazione di coppie elettrone-lacuna in ammassi di carbonio ibridati sp2 localizzati con strutture cristalline e amorfe, secondo altri rapporti simili. Inoltre, la dipendenza dall'eccitazione deriva principalmente da diversi dimensioni dei Re-CD (effetto quantistico) e/o diverse trappole emissive sul meccanismo di superficie dei Re-CD.Era anche comprensibile in termini di due o più centri PL indotti dalle complicate strutture dei Re-CD.52,53 Le figure 3C e F mostrano l'assorbimento cellulare e la bioimmagine dei Re-CD nelle cellule tumorali A375.I Re-CD possedevano proprietà PL di emissione dipendenti dall'eccitazione.La luce blu, verde e rossa verrebbe emessa quando eccitata sotto il laser UV, blu e verde, rispettivamente.Per dimostrare che la fluorescenza proveniva da Re-CD, abbiamo preso cellule A375 non trattate come illustrazione.Le immagini di controllo sono mostrate nella Figura S4.Abbiamo anche quantificato i segnali fluorescenti utilizzando il programma ImageJ.I valori dell'intensità del segnale/pixel erano 0,077, 0,070 e 0,067, che corrispondevano rispettivamente a rosso, verde e blu.I risultati erano coerenti con gli spettri di fluorescenza.Le eccellenti proprietà luminescenti dei Re-CD sono alla base di diffuse applicazioni in campo biologico.Figura 3 Proprietà fluorescenti e imaging cellulare di Re-CD.Note: (A) Spettro UV-vis dei Re-CD.(B) Gli spettri di emissione PL di Re-CD con lunghezze d'onda di eccitazione progressivamente più lunghe da 320 a 540 nm con incrementi di 20 nm.(C–F) Imaging cellulare di cellule A375 trattate con Re-CD sotto eccitazione di luce ultravioletta (C, 360–380 nm), blu (D, 460–480 nm), verde (E, 510–530 nm) e campo luminoso (F).Abbreviazioni: PL, fotoluminescenza;Re-CD, punti di carbonio Re-based;UV–vis, ultravioletto–visibile.Analisi HPLC della soluzione Re-CDAbbiamo testato la soluzione Re-CDs sotto la condizione di analisi di ginsenosidi rari per studiare la possibile esistenza di costituenti derivati ​​dal ginsenoside Re.I risultati dell'HPLC, che potrebbero illustrare l'effetto antitumorale dei Re-CD in un aspetto, sono visualizzati nella Figura 4. Combinando il tempo di ritenzione dei picchi negli spettri HPLC e le informazioni sullo spettro di massa presentate nella Tabella S1, potremmo eseguire un'analisi qualitativa del Soluzione per ri-CD.I risultati hanno indicato che il raro ginsenoside Rg2, 20(R)-Rh1, Rg6, F4, Rk3 e Rh4 potrebbe essere rilevato in una soluzione di Re-CD.Ha dimostrato che nella condizione di sintesi idrotermale, l'eliminazione e la disidratazione del glicosile si verificano in un sistema chiuso e una parte del ginsenoside Re è stata degradata a diversi tipi di ginsenosidi rari Re-derivati ​​durante il processo.È stato dimostrato che questi rari ginsenosidi hanno una bioattività estremamente elevata, compreso l'effetto antitumorale.54,55 Quindi, suggeriamo che l'esistenza di ginsenosidi rari che possono assorbire sulla superficie dei Re-CD e possono rilasciarsi in una soluzione di Re-CD è responsabile dell'antitumorale effetto.Figura 4 L'analisi HPLC della soluzione standard di (A) diversi ginsenosidi rari e Re-CD (B).Note: Il tipo di ginsenoside rappresentato dal numero è il seguente: (1) 20(S)-Rh1;(2) Rg2;(3) 20(R)-Rh1;(4) Rg6;(5) F4;(6) Rk3;(7) Rh4;(8) 20(S)-Rg3;(9) 20(S)-Rg3;(10) Rk1;(11) Rg5;(12) 20(S)-Rh2;(13) 20(R)-Rh2;(14) Rk2;(15) Rh3.C'erano sei tipi di ginsenosidi rari derivati ​​dal ginsenoside Re nella soluzione di Re-CD.Abbreviazione: Re-CDs, Re-based carbon dots.Effetto di inibizione delle cellule trattate con Re-CD in vitroLa Figura 5A mostra l'inibizione in vitro dei Re-CD che sono stati coltivati ​​con cellule per 24 ore.C'era una relazione dose-dipendente tra la vitalità cellulare delle cellule tumorali (MCF-7, A375 e HepG2) e la concentrazione di Re-CD.La vitalità delle cellule tumorali è diminuita significativamente con l'aumento della concentrazione di Re-CD, mentre quella delle cellule normali (293T) è rimasta al di sopra del 90%.Abbiamo anche preso in considerazione altre cellule normali come normali cellule epatiche umane HL-7702(L-02), NSFb umane e normali cellule epiteliali mammarie MCF-10A.I risultati sono mostrati nella Figura S5.La figura dimostra che i Re-CD hanno mostrato un'eccellente attività di inibizione sulle cellule tumorali e scarso effetto sulle cellule normali.I valori IC50 di HepG2, MCF-7 e A375 erano rispettivamente 1,05, 0,529 e 0,223 mg/mL.Tra le linee cellulari tumorali, l'A375 trattata con Re-CD ha mostrato l'inibizione più significativa.I risultati hanno anche indicato che rispetto ad alcuni farmaci commerciali, tra cui cisplatino, metotrexato e doxorubicina per la terapia del cancro, i Re-CD hanno mostrato un'efficace inibizione delle cellule tumorali con una minore tossicità per le cellule normali.Abbiamo preparato i CD che costituiscono solo CA e EDA.I risultati di citotossicità del test CCK-8 sono mostrati nella Figura S6A.Tutti i diritti riservati.Registrato in Inghilterra e Galles.