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topi con insufficienza cardiaca.Il nostro studio ha mostrato effetti terapeutici potenziati di hiPS-CM indotti in modo ottimale attenuando il rimodellamento cardiaco e la disfunzione, questi effetti benefici erano concomitanti con una ridotta morte dei cardiomiociti e una maggiore angiogenesi.Inoltre, gli hiPS-CM indotti in modo ottimale potrebbero raccogliersi nel cuore ferito e nascondere un abbondante PDGF-BB.L'effetto riparativo degli hiPS-CM indotti in modo ottimale negli HCM danneggiati dall'ipossia è stato imitato da PDGF-BB ma inibito dall'anticorpo neutralizzante PDGF-BB, che era accompagnato dall'espressione modificata delle proteine ​​p-PI3K e p-Akt.È altamente possibile che il percorso PI3K/Akt sia regolato dal PDGF-BB secreto dagli hiPS-CM indotti dal composto per ottenere un effetto di riparazione del miocardio più duraturo rispetto agli hiPS-CM indotti standard.Presi insieme, i nostri dati implicano fortemente che gli hiPS-CM indotti dal composto promuovono il recupero dei cuori feriti attraverso l'azione paracrina.In questo processo, il fattore paracrino PDGF-BB derivato dall'hiPS-CMs indotto dal composto riduce il rimodellamento cardiaco avverso indotto dall'isoproterenolo, che è associato a una migliore funzione cardiaca, e questi effetti sono mediati dalla via PI3K/Akt, suggerendo che il gli hiPS-CM indotti possono servire come una nuova promettente terapia cellulare per applicazioni cliniche.Nonostante i notevoli progressi recenti nella gestione medica e chirurgica delle malattie cardiache, fino al 10% dei pazienti con insufficienza cardiaca alla fine progredisce verso l'insufficienza cardiaca avanzata e allo stadio terminale, che rimane una delle principali cause di morte in tutto il mondo.1,2 L'attuale gold standard la terapia nell'insufficienza cardiaca avanzata è limitata al supporto cardiaco meccanico o al trapianto cardiaco, ma la maggior parte dei pazienti non trae beneficio da queste terapie poiché i candidati idonei superano di gran lunga il numero degli organi donatori disponibili.Poiché il cuore non ha il potenziale rigenerativo per sostituire la drammatica perdita cellulare che si verifica durante lo scompenso cardiaco, numerose terapie precliniche e cliniche con cellule staminali sono state studiate intensamente.3,4,5,6,7 Tuttavia, il tipo cellulare ideale e il più efficace modo per quelle terapie non sono ancora disponibili.8,9,10Un approccio terapeutico, che presenta numerosi vantaggi, è la conversione delle cellule iPS in cardiomiociti.Convertendo le cellule auto-somatiche in cardiomiociti, si può ridurre il rischio di rigetto poiché le cellule sono autologhe.11,12 Studi in cui sono stati iniettati hiPS-CM o aggregati battenti derivati ​​da iPS hanno mostrato aumenti positivi della funzione cardiaca e una ridotta dimensione dell'infarto senza alcuna segnalazione di formazione di teratomi.13,14 Nonostante questi risultati promettenti, molte linee di evidenza indicano che nelle condizioni attualmente utilizzate, gli hiPS-CM non mostrano le caratteristiche morfologiche e funzionali dei cardiomiociti più maturi, il che è una barriera alla loro uso.Il principale problema tecnico in questo approccio è garantire un numero sufficiente di cardiomiociti funzionali con elevata purezza.Per risolvere questi problemi, qui abbiamo riportato un metodo per la formazione di hiPS-CMs e la maturazione funzionale aggiungendo il nostro composto saponin+ preparato in modo univoco (composto principalmente da saponina e altre piccole molecole ben definite) sulla base della nostra precedente esperienza di ricerca.15 Infine, in modo ottimale ha generato gli hiPS-CM indotti dal composto che erano altamente coerenti con le caratteristiche fisiologiche dell'ultimo stadio dello sviluppo del cuore fetale senza la necessità di cellule esogene o manipolazione genetica.Abbiamo anche confrontato la sicurezza e l'efficacia del trapianto di hiPS-CMs indotto dal composto in un modello di insufficienza cardiaca, dimostrando un effetto protettivo del trapianto di hiPS-CMs indotto dal composto per la terapia dell'insufficienza cardiaca.Nell'ulteriore studio del meccanismo, abbiamo utilizzato la tecnologia di sequenziamento per analizzare i cuori dei topi per la specifica via di segnalazione del gruppo di trapianto hiPS-CMs indotto dal composto e i fattori paracrini altamente espressi nel surnatante della coltura hiPS-CMs sono stati rilevati dalla proteina citochina Vettore.Da questi esperimenti, PDGF-BB è stato identificato come il fattore chiave per regolare il percorso PI3K/Akt per riparare la lesione dei cardiomiociti sulla base degli studi meccanicistici del modello HCMs in vitro danneggiato da ipossia.Collettivamente, i nostri risultati hanno rivelato un fattore paracrino PDGF-BB degli hiPS-CM indotti dal composto, che può contribuire agli effetti cardio-riparativi del trapianto di hiPS-CM e ai meccanismi alla base della terapia.Questi risultati non solo forniscono nuove informazioni sul meccanismo del PDGF-BB nella riparazione dei cardiomiociti, ma arricchiscono anche la nostra comprensione di come gli hiPS-CM indotti dal composto promuovono la riparazione del cuore ferito.Prima della differenziazione, abbiamo esaminato la pluripotenza e il cariotipo degli hiPSC al giorno 0 e abbiamo scoperto che oltre il 95% delle cellule esprimeva altamente NANOG, OCT4, SOX2 e SSEA4 e aveva un cariotipo normale (Figura 1 supplementare).Sulla base dei metodi di ricerca precedenti,16 abbiamo integrato un protocollo di differenziazione di base chiamato “schema di induzione standard”.Abbiamo usato per la prima volta CHIR99021 per inibire il percorso β GSK3, seguito in sequenza da bFGF e IWP2.Successivamente, le cellule sono state purificate e mantenute fino a quando non si sono ulteriormente sviluppate in cardiomiociti battenti (film S1).Successivamente, abbiamo esplorato il momento migliore per indurre la differenziazione dei cardiomiociti aggiungendo la miscela di medicina cinese allo schema di induzione standard in diversi momenti del 3°, 5° e 7° giorno.I risultati quantitativi della reazione a catena della trascrizione inversa-polimerasi (RT-PCR) hanno mostrato che l'espressione dei geni marcatori cellulari indifferenziati (NANOG, POU5F1, FGF4, ESG1, DPPA2 e DPPA4) era significativamente inferiore e l'espressione dei geni marcatori cardiaci (cTNI , ACTN1, TNNT2, GJA1, NKX2.5, GATA4 e MEF2C) era molto più alto nel gruppo Mix-day3 rispetto a quello degli altri gruppi (Fig. 1a).Pertanto, il 3° giorno è il momento migliore per iniziare la differenziazione indotta da Mix.Quindi i tassi di differenziazione sono stati rilevati mediante citometria a flusso, che ha mostrato che le proporzioni di cellule che esprimono c-TNI nel gruppo indotto da Mix e standard erano del 92,3% rispetto al 35,9% (Fig. 1b).Sviluppare l'efficace composto saponin+ derivato dalla miscela della medicina cinese per indurre in modo ottimale la differenziazione di hiPS in cardiomiociti.un'espressione genica di hiPS-CM non purificati indotta in modo ottimale dalla miscela di medicina cinese in diversi momenti di intervento.Analisi quantitative della reazione a catena della trascrizione-polimerasi inversa (RT-PCR) dei livelli di espressione di geni marcatori cellulari indifferenziati (NANOG, POU5F1, FGF4, ESG1, DPPA2 e DPPA4) e geni marcatori cardiaci (cTNI, ACTN1, TNNT2, GJA1, NKX2 .5, GATA4 e MEF2C).*P < 0,05.b La citometria a flusso è stata utilizzata per rilevare il tasso positivo di hiPS-CM non purificati indotti in modo ottimale dalla miscela di medicina cinese.L'istogramma rappresentativo di hiPS-CM dopo la differenziazione ha mostrato la proporzione di cellule che esprimono cTnI.c Identificazione dei principi attivi nella miscela di medicina cinese mediante LC–IT-TOF-MS.Sono state mostrate le strutture chimiche principali degli ingredienti principali ag.d Esplorare la concentrazione ottimale di ciascun ingrediente attivo nella miscela della medicina cinese per indurre le cellule P19 a differenziarsi in cardiomiociti mediante un sistema di screening farmacologico basato sul promotore Myh6.I grafici a barre rappresentavano medie e deviazioni standard, ciascuna eseguita in triplicato.L'asterisco indicava la significatività statistica (P <0,05).e Esplorare le combinazioni ottimali di principi attivi nella miscela della medicina cinese per indurre le cellule P19 a differenziarsi in cardiomiociti mediante un sistema di screening farmacologico basato sul promotore Myh6.f Rappresentazione schematica della procedura di differenziazione e dei cambiamenti morfologici sequenziali (giorno 0–15) della differenziazione dell'hiPS in cardiomiociti indotta dal composto efficace della saponina+.Barre di scala = 50 μm.hiPS, cellula staminale pluripotente indotta dall'uomoLC–IT-TOF-MS è stato applicato per la caratterizzazione delle sostanze legate al processo in Mix e sono stati determinati sette ingredienti principali.Tra gli ingredienti identificati (Fig. 1c), abbiamo potuto vedere che le saponine erano i principali costituenti chimici, 6 ingredienti principali erano identificati inequivocabilmente come icariina (etichettata come ingrediente "a"), acido salvianolico B (etichettato come ingrediente "b"), sfingosina-1-fosfato (etichettato come ingrediente "c"), astragaloside (etichettato come ingrediente "d"), ginsenoside rg1 (etichettato come ingrediente "e") e PLGF-2 (etichettato come ingrediente "f").Inoltre, un nuovo isomero dello scropolioside D (etichettato come ingrediente "g") è stato provvisoriamente caratterizzato nei presenti esperimenti.Quindi, la concentrazione ottimale del singolo ingrediente per indurre le cellule staminali a differenziarsi in cardiomiociti è stata valutata costruendo il plasmide psiCheck-2-Myh6 del gene reporter della luciferasi ricombinante.La catena pesante α-miosina (α-MHC) codificata da Myh6 è una proteina specifica del miocardio, maggiore è l'intensità della luciferasi, maggiore è la capacità di differenziare i cardiomiociti.Il sistema del gene reporter della luciferasi è stato verificato dal farmaco positivo allo 0,5% di dimetilsolfossido per indurre le cellule P19 ai cardiomiociti.Inizialmente, il livello di espressione della luciferasi era inferiore nel gruppo di controllo, ma dopo cellule P19 in presenza di 20 μg/mL di icariina, 10 μg/mL di acido salvianolico B, 20 nM di sfingosina-1-fosfato, 20 μg/mL di astragaloside, 20 μg/mL di ginsenoside rg1, 2,5 ng/mL di PLGF-2 o 10 μg/mL di nuovo isomero di scropolioside D separatamente, l'attività della luciferasi ha raggiunto un livello massimo (Fig. 1d).Inoltre, nello screening del primo round è stato testato un composto completo contenente l'ingrediente ag (etichettato come "Compound-abcdefg").I risultati hanno mostrato che il nostro composto completo ottimizzato aveva una capacità superiore di indurre le cellule P19 a differenziarsi in cardiomiociti rispetto a quella del gruppo di controllo positivo.Nella seconda fase di screening, sette composti (etichettati come “Compound-bcdefg”, “Compound-acdefg”, “Compound-abdefg”, “Compound-abcefg”, “Compound-abcdfg”, “Compound-abcdeg” e “ Compound-abcdef") sono stati preparati rimuovendo gli ingredienti uno per uno dal composto a componente completo e i risultati statistici hanno mostrato che lo smantellamento di qualsiasi singolo ingrediente ridurrebbe la capacità del composto a componente completo di indurre la differenziazione dei cardiomiociti a vari livelli (Fig. 1e) .Pertanto, abbiamo dato la priorità al composto a componenti completi per la preparazione unica del composto saponin+.Inoltre, abbiamo verificato e sviluppato con successo un protocollo di differenziazione ottimizzato nel sistema hiPS chiamato "Schema di induzione composto" utilizzando lo schema di induzione standard combinato e i metodi di differenziazione del composto a componenti completi (Fig. 1f).Utilizzando questo schema di induzione ottimizzato, abbiamo ottenuto cardiomiociti battenti più forti (Film S2).È stato sviluppato uno speciale sistema di perfusione microfluidica per confrontare la stabilità di hiPS-CM differenziati (Figura 3a, b supplementare).I risultati presentati hanno mostrato che gli hiPS-CM indotti dallo standard nel dispositivo microfluidico hanno portato a un'evidente perdita di hiPS-CM rispetto ai piatti di coltura il 4° e il 5° giorno (l'area del 20% di perdita cellulare è contrassegnata in rosso) e l'inizio -il tempo di battimento è stato ritardato al 10° giorno (il 35% dell'area del battito cellulare è contrassegnata in verde).Tuttavia, gli hiPS-CM indotti dal composto nel dispositivo microfluidico hanno mostrato stabilità del processo di differenziazione e oltre il 70% degli hiPS-CM pulsava già nel 9° giorno (Figura 3c supplementare).Abbiamo raccolto cellule in vari punti temporali durante il protocollo di differenziazione standard e composto ed eseguito RNA-seq per cercare l'espressione trascrittomica dei marcatori specifici della differenziazione dei cardiomiociti.È stato importante notare che la differenza nell'espressione di GATA4, Nkx2.5, α-MHC e c-TNI nei gruppi di induzione standard e composta ha iniziato ad ampliarsi dal giorno 5 e i livelli di espressione dei marcatori di maturazione precoce cardiaca GATA4 e Nkx2.5 nel gruppo di induzione composta erano più alti tra i giorni 5 e 15 e i suoi marcatori di maturazione tardiva cardiaca α-MHC e c-TNI aumentavano rapidamente e superavano il gruppo di induzione standard dall'8° giorno (Fig. 2a).Le analisi GO hanno rivelato che la regolazione positiva della proliferazione cellulare, della giunzione cellulare e del legame degli ioni calcio erano i termini più alti nel gruppo di induzione del composto al 5° giorno.Al 15° giorno di differenziazione, la risposta cellulare al farmaco, la giunzione cellulare e il legame dell'actina erano rispettivamente i termini GO più alti (Fig. 2b).Tra gli unigeni comuni dell'analisi KEGG (P <0, 05), le rappresentazioni più alte erano la giunzione gap, la via PI3K-Akt, la via del calcio e la regolazione del citoscheletro di actina sia al giorno 5 che 15 dopo la differenziazione (Fig. 2c).Inoltre, abbiamo confrontato i dati RNA-seq di hiPS-CM indotti da standard purificati (STD) e hiPS-CM indotti da composti (COMP) al 15° giorno di differenziazione con i dati sui geni di cuori fetali/adulti.È stato riscontrato che la maturità di STD e COMP era più vicina a quella del cuore fetale (Fig. 2d, e).Inoltre, abbiamo confrontato STD e COMP rispettivamente con i cardiomiociti fetali, è stato dimostrato che COMP esprimeva più geni in fase avanzata dello sviluppo del cuore fetale, mentre STD esprimeva più geni in fase iniziale (Fig. 2f-h), indicando che COMP ha una maggiore maturità rispetto a STD.Profilazione dell'espressione genica degli hiPS-CM indotti standard e composti da linee hiPSC UC (riprogrammati da cellule di urina).un profilo di espressione genica RNA-Seq dei marcatori di maturazione dei cardiomiociti GATA4, Nkx2.5, α-MHC e c-TNI al giorno 0, 5 e 15 della differenziazione hiPS standard e indotta dal composto.Log2FC sull'asse y ha indicato l'entità delle differenze genetiche tra i gruppi (STD-CM, COMP-CM) in due punti temporali di differenziazione separati (giorno 5, giorno 15).Il cambiamento di piega (FC) rappresentava il cambiamento di piega differenziale nell'mRNA differenziale tra i due gruppi.Log2FC è stato ottenuto prendendo il logaritmo di FC alla base di 2. b GO classificazione funzionale degli hiPS-CM standard e composti indotti al giorno 5 e al giorno 15. Termini GO assegnati a processo biologico, componente cellulare e funzioni molecolari.c Classificazione funzionale KEGG degli hiPS-CM indotti standard e composti al giorno 5 e 15. COMP-D5, gli hiPS-CM indotti dal composto al giorno 5;STD-D5, gli hiPS-CM indotti standard al giorno 5;COMP-D15, il composto ha indotto hiPS-CM al giorno 15;STD-D15, gli hiPS-CM indotti dallo standard al giorno 15. d L'analisi delle componenti principali (PCA) è stata eseguita sulla base dei geni condivisi di STD (D15), COMP (D15), fetale e adulto.I primi tre componenti principali (PC) separavano STD, COMP da Fetale e Adulto.I primi due assi rappresentavano il 61,96% della varianza.La prima componente principale (PC) spiegava il 44,45% della varianza nei valori di espressione e separava efficacemente STD, COMP, Fetale e Adulto.La combinazione della seconda e della terza componente principale separava ulteriormente STD, COMP, Fetale e Adulto.Ogni simbolo rappresentava un campione.e Rappresentazione schematica della matrice di correlazione.Correlazione di Spearman tra diversi campioni.L'effetto del gradiente di colore quadrato ha mostrato il coefficiente di correlazione.I valori della matrice di correlazione vanno da -1 a 1, che rappresentano rispettivamente una correlazione completamente negativa o positiva.f Il diagramma di Venn ha mostrato la sovrapposizione tra geni fetali derivati ​​da set di dati GEO e geni in STD (D15) o geni in COMP (D15).Il feto condivideva rispettivamente 17.174 e 17.059 geni con STD e COMP.g Heatmap ha mostrato l'espressione dei geni caratteristici dello sviluppo cardiaco nelle fasi iniziali e tardive nei geni sovrapposti di "STD vs. Fetale" e "COMP vs. Fetale", il che indicava che l'espressione dei geni identificati aveva modelli di espressione diversi in questi tipi di campioni.L'espressione è indicata come z-score normalizzato.h I grafici a barre a colonne impilate descrivono l'espressione genica media nella fase iniziale e avanzata dello sviluppo cardiaco.COMP ha espresso una percentuale maggiore di geni allo stadio avanzato dello sviluppo del cuore rispetto a STD, mostrando caratteristiche più matureAbbiamo confrontato le funzioni elettrofisiologiche di hiPS-CM dalle linee hiPSC UC di MEA alle condizioni basali, dopo un trattamento con 100/50 nM ISO o 10/5 μM di lidocaina.Le mappe di attivazione generate ottenute dalla condizione basale dai gruppi hiPS-CMs indotto da composto e standard hanno mostrato un modello generale di attivazione sequenziale, mentre il gruppo di induzione standard dopo il trattamento ISO ha mostrato un modello disordinato con variazioni da battito a battito e la direzione di propagazione era completamente invertito rispetto al basale (Fig. 3a).Osservazioni simili sono state fatte costantemente nel potenziale di campo, dove il gruppo di induzione composto potrebbe rispondere con una tensione di potenziale di campo stabile dopo la stimolazione con ISO/lidocaina (Fig. 3b).Dopo l'attivazione da parte di ISO, il tempo di depolarizzazione e ripolarizzazione degli hiPS-CM indotti dal composto sono stati significativamente ridotti e regolari negli ordini, mentre gli hiPS-CM indotti standard hanno mostrato disturbi irregolari.Dopo diverse concentrazioni di trattamento con lidocaina, gli hiPS-CM indotti dal composto hanno mostrato una risposta dose-dipendente stabile, mentre nessun segnale o solo segnali deboli residui sono stati rilevati negli hiPS-CM indotti standard (Fig. 3c).Inoltre, le statistiche sugli indicatori di quantificazione del potenziale di campo e della ripolarizzazione hanno mostrato che gli hiPS-CM indotti dal composto avevano una maggiore sensibilità e tolleranza ai farmaci, la loro funzione di conduzione elettrofisiologica era più stabile rispetto agli hiPS-CM indotti standard (Fig. 3d).Inoltre, i transitori di calcio hanno mostrato una fluorescenza di picco significativamente più alta e hanno aumentato la frequenza negli hiPS-CM indotti dal composto rispetto al gruppo hiPS-CM indotto standard (Fig. 3e).Nel frattempo, abbiamo indotto i cardiomiociti con un'altra linea hiPSC BC e ripetuto gli esperimenti sopra e ottenuto risultati simili (Figura 6a-f supplementare).Confronto di elettrogrammi extracellulari e misurazione intracellulare di Ca2+, nonché struttura e maturità funzionale degli hiPS-CM indotti da standard e composti da linee hiPSC UC (riprogrammate da cellule di urina).a Una mappa di attivazione che funge da rappresentazione visiva della sequenza di attivazione registrata mediante il sistema di acquisizione dati MEA.Il tempo di attivazione della mappa (l'intervallo di tempo tra la prima e l'ultima attivazione) è rappresentato dalla scala inferiore in fondo alla mappa.La striscia di colori sotto la mappa rappresenta lo spettro dei colori e il suo ridimensionamento in base al tempo.Codifica colore: rosso-presto;blu in ritardo.b Una visualizzazione rappresentativa degli elettrogrammi registrati dall'intero array MEA.I cardiomiociti a battito spontaneo sono stati verificati mediante elettrogrammi extracellulari registrati il ​​3° giorno dopo la semina e la coltura cellulare.c Sistema di elettrodi a micromatrice MEA per rilevare i cambiamenti del potenziale di campo e della forma d'onda di fase durante la depolarizzazione/ripolarizzazione di hiPS-CM.d Le proprietà elettriche delle cellule sono state studiate con MEA, che ha rivelato le differenze tra il gruppo hiPS-CM indotto da standard e composto.FPD, durata del potenziale di campo.e Flusso di calcio in hiPS-CMs al giorno 15 dell'induzione.I transitori di calcio sono stati registrati alla condizione basale.Le immagini hanno mostrato tracce di transitori di calcio.Frequenza transitoria del calcio allo stato basale (n = 4-5).I dati sono stati presentati come media ± SEM.*P < 0,05.f Caratteristiche morfologiche e strutturali dei mitocondri negli hiPS-CM viventi etichettati con sonda fluorescente verde mitocondriale (MTG).Barre di scala = 50 μm.g L'intensità della fluorescenza della colorazione TMRE, Rhod-2 e cito C è stata quantificata utilizzando ImageJ, * P <0, 05.h Esame ultrastrutturale di miofilamenti, microfilamenti e mitocondri di hiPS-CMs.La freccia rossa indicava il miofilamento.La freccia nera indicava il microfilamento.Le frecce gialle indicavano i mitocondri.La freccia viola indicava il reticolo endoplasmatico.Il cerchio rosso indicava l'accumulo di glicogeno.Barre di scala = 1 μmNel gruppo di induzione standard, i mitocondriali etichettati con MTG apparivano come punti e bastoncelli corti.Nel gruppo di induzione composta, la morfologia mitocondriale era relativamente estesa, sotto forma di rete e linee lunghe (Fig. 3f).Il potenziale della membrana mitocondriale non differiva tra i due gruppi nelle condizioni basali (Fig. 3g e Fig. 5a supplementare), mentre il calcio mitocondriale era significativamente più basso negli hiPS-CM indotti dal composto (Fig. 3g e Fig. 5b supplementare).Inoltre, c'era un maggiore accumulo di cito C nei mitocondri negli hiPS-CM indotti dal composto rispetto agli hiPS-CM indotti standard (P <0, 05) e in entrambi i gruppi non è stato osservato alcun rilascio di cito C nel citoplasma (Fig. .3g e Figura 5c supplementare).Inoltre, la formazione di citoscheletro come i microfilamenti cellulari e i miofilamenti potrebbe essere vista al microscopio elettronico negli hiPS-CM indotti da composti (Fig. 3h), mentre nessun tipico miofilamento è stato trovato negli hiPS-CM indotti standard e l'accumulo di glicogeno era ovvio.Inoltre, abbiamo ripetuto gli esperimenti precedenti utilizzando un'altra linea hiPSC BC e ottenuto risultati simili (Figura 7a-f supplementare).Abbiamo trapiantato gli hiPS-CM indotti standard e composti nei topi 1 settimana dopo il successo della modellazione (Fig. 4a).Quindi è stata eseguita l'imaging non invasivo per valutare l'homing e la biodistribuzione.I segnali di imaging più elevati nel COMP indicavano che più hiPS-CM si stavano raccogliendo nei cuori feriti rispetto a STD.La durata dell'attività del segnale fluorescente nel cuore locale era di 18 giorni e il tempo di decadimento del segnale relativo era in ritardo nel COMP, molto più lungo del STD (Fig. 4b).Effetti del trapianto di hiPS-CMs indotto standard e composto sulla funzione cardiaca e sul metabolismo energetico del miocardio.un protocollo di studio degli esperimenti di trapianto di hiPS-CMs in topi con insufficienza cardiaca.b L'imaging a fluorescenza in vivo di topi ha dimostrato che gli hiPS-CM indotti dal composto esogeno etichettati con CM-DiL potrebbero raccogliersi rapidamente nel miocardio danneggiato.La quantificazione dell'intensità della fluorescenza ha mostrato un effetto di aggregazione cardiaca più lungo negli hiPS-CM indotti dal composto rispetto al gruppo di trapianto di hiPS-CM indotto standard.L'intensità quantitativa della fluorescenza è stata mostrata a destra, n = 4 per ciascun gruppo.c L'elettrocardiogramma (ECG) è stato eseguito 4 e 8 settimane dopo il trapianto di hiPS-CMs.n = 4–6 per ogni gruppo.Tracce rappresentative di registrazioni ECG telemetriche di topi hanno mostrato un ritmo sinusale normale.d Effetti degli hiPS-CM indotti standard e composti sulla struttura ventricolare e sulla funzione dei topi con insufficienza cardiaca a 4 e 8 settimane mediante ecocardiografia.Immagini rappresentative in modalità M da ciascun gruppo in cui sono stati derivati ​​i numeri utilizzati per i calcoli.n = 5–7 per ogni gruppo.EF, frazione di eiezione;FS, accorciamento frazionario;LVEDV, volume telediastolico del ventricolo sinistro;LVESV, volume telesistolico del ventricolo sinistro;LVIDd, dimensione diastolica interna del ventricolo sinistro;LVIDs, dimensione sistolica interna del ventricolo sinistro;LVPWd, dimensione della parete posteriore del ventricolo sinistro in diastole;LVPWs, dimensione della parete posteriore del ventricolo sinistro in sistole.e Il metabolismo miocardico è stato valutato tramite l'assorbimento di 18F-DPA-714 mediante micro-PET/CT.n = 3 per ogni gruppo.Sono state mostrate immagini di ricostruzione 3D rappresentative da viste globali, trasversali e di altro tipo di ciascun gruppo.Il livello di assorbimento di glucosio più elevato è stato mostrato come l'aumento dell'intensità del bianco e del rosso come indicato sulla barra della scala dei colori mostrata in ciascuna immagine.Il calcolo del SUVmax e del rapporto di assorbimento ha mostrato che il gruppo di trapianto di hiPS-CMs indotto dal composto aveva un livello di assorbimento di glucosio significativamente aumentato.STD, gruppo di trapianto hiPS-CMs standard indotto;COMP, gruppo di trapianto hiPS-CMs indotto da compostiL'ECG del rilevamento di topi trapiantati con hiPS-CM in diversi momenti ha rivelato un'ampiezza dell'onda R significativamente ridotta.L'evidente recupero dell'ampiezza dell'onda R si è verificato entro le prime 4 settimane, ma si è accorciato nuovamente dopo 8 settimane.L'incidenza di bradicardia sinusale era più alta nell'ottava settimana dopo il trapianto di hiPS-CMs.Nessuna differenza significativa è stata trovata nella frequenza cardiaca o nell'ampiezza dell'onda R tra i gruppi di trapianto hiPS-CM indotto da composto e standard nell'ottava settimana (Fig. 4c).L'ecocardiografia transtoracica standard seriale è stata eseguita prima e 4 e 8 settimane dopo il trapianto di hiPS-CMs (Fig. 4d).Sia le terapie di trapianto hiPS-CM indotte standard che quelle composte hanno mostrato un miglioramento dell'EF rispetto al gruppo modello.Successivamente, l'EF all'ottava settimana era significativamente maggiore nel gruppo hiPS-CMs indotto da composto rispetto a quello nel gruppo hiPS-CMs indotto standard (52,79 ± 5,65% contro 45,41 ± 4,58%, P <0,05).FS era anche significativamente maggiore nel gruppo hiPS-CMs indotto da composti.Inoltre, gli indici che riflettevano il rimodellamento miocardico come LVESV e LVID all'ottava settimana nel gruppo hiPS-CM indotti da composti erano più piccoli di quelli nel gruppo hiPS-CM indotti standard.Questi parametri indicavano che gli hiPS-CM indotti dal composto avevano effetti più forti sul miglioramento delle prestazioni miocardiche rispetto agli hiPS-CM indotti standard.Micro-PET/CT è stato utilizzato per analizzare il livello di assorbimento del glucosio dopo il trapianto di hiPS-CMs (Fig. 4e).Dai risultati della composizione 3D, i topi con insufficienza cardiaca potrebbero fornire un apporto energetico al miocardio in stato di insufficienza migliorando il metabolismo del glucosio.Rispetto ai topi con insufficienza cardiaca, il metabolismo del glucosio miocardico è stato significativamente aumentato dopo il trattamento con hiPS-CM, mentre gli hiPS-CM indotti da composti hanno promosso il metabolismo del glucosio in modo più evidente rispetto agli hiPS-CM indotti standard.Quindi, abbiamo eseguito la scansione 2D a più angolazioni per quantificare l'assorbimento di glucosio.Il SUVmax e il rapporto di assorbimento erano significativamente più alti, specialmente a 8 settimane, nel gruppo hiPS-CMs indotto da composti rispetto a quello nel gruppo hiPS-CMs standard indotto, nel gruppo di controllo o nel gruppo modello (P <0,05).Per valutare la sicurezza e l'efficacia del trapianto di hiPS-CMs, abbiamo rimosso cuore, fegato, milza, polmone e rene per confronti morfologici e abbiamo osservato cambiamenti significativi nella morfologia cardiaca a 4 e 8 settimane dopo il trapianto di hiPS-CMs (Fig. 5a).Quindi abbiamo misurato le dimensioni del cuore e abbiamo scoperto che dopo 8 settimane di insufficienza cardiaca, il cuore ha iniziato ad espandersi in modo significativo e il cuore ingrossato dopo il trapianto di hiPS-CM aveva diversi gradi di retrazione.Rispetto al gruppo hiPS-CM indotto standard, il cuore nel gruppo hiPS-CM indotto dal composto si è ripreso in modo più evidente, ma i cambiamenti morfologici caratteristici di cui sopra non erano evidenti a 4 settimane (Fig. 5b, h).Inoltre, non è stata riscontrata alcuna formazione di teratoma in tutti gli organi principali (Fig. 5c) e non è stato osservato alcun danno funzionale epatico o renale specifico (Tabella 1).Quindi, abbiamo esaminato l'ultrastruttura del miocardio in ciascun gruppo.Otto settimane dopo il trapianto di hiPS-CMs, le miofibrille del miocardio si sono ovviamente riprese, la struttura della linea Z tendeva ad essere completa e i miofilamenti erano strettamente organizzati, ma c'era ancora un leggero gonfiore e vacuolizzazione dei mitocondri negli hiPS indotti standard -CMs e la scomparsa delle creste mitocondriali persisteva nel gruppo hiPS-CMs indotto dal composto (Fig. 5d).Gli effetti del composto hanno indotto hiPS-CMs sulla struttura cardiaca e sull'espressione dei fattori di secrezione del sangue periferico dopo 8 settimane dal trapianto.a Valutazione preliminare della sicurezza mediante confronto macroscopico di importanti morfologie di organi.b L'analisi del diametro a 8 settimane dopo il trapianto ha mostrato dimensioni del cuore significativamente più piccole nel gruppo di trapianto di hiPS-CM indotto da composti rispetto al gruppo del modello di insufficienza cardiaca.c Né l'analisi macroscopica né quella microscopica hanno rivelato alcuna evidenza di formazione di tumore a 4 e 8 settimane dopo il trapianto di hiPS-CMs.d I cambiamenti ultrastrutturali nei cardiomiociti dei gruppi trapiantati di controllo, modello e hiPS-CM sono stati rivelati dall'analisi al microscopio elettronico a trasmissione a ingrandimenti bassi (barra della scala: 5 μm) e alti (barra della scala: 1 μm).È stato eseguito il test TUNEL per rilevare l'apoptosi miocardica.I nuclei apoptotici erano colorati di verde e i nuclei normali erano colorati di blu.Barra della scala: 50 μm.f Neoangiogenesi microvascolare a 8 settimane dopo il trapianto di hiPS-CMs.Colorazione immunofluorescente per microvasi positivi per α-actina del muscolo liscio (α-SMA) e CD31 nel ventricolo sinistro.Barra della scala: 200 μm.g Fotografie rappresentative della fibrosi miocardica, determinate dalla colorazione tricromica di Masson.Il colore blu rappresentava la distribuzione dei collageni.h L'analisi statistica dell'apoptosi miocardica, della neoangiogenesi microvascolare e della colorazione della fibrosi è stata quantificata utilizzando ImageJ.i L'espressione della proteina c-TNI è stata analizzata mediante Western blotting e normalizzata a GAPDH.j La PCR in tempo reale è stata utilizzata per valutare i livelli di mRNA del fattore di trascrizione cardiaca GATA4 e Nkx2.5 nel cuore.k Espressione di marker di danno miocardico nel sangue periferico.CK, CK-MB e LDH sono indicatori molto sensibili e specifici di danno al miocardio.l Espressione di fattori secretori nel sangue periferico.Il BNP è un fattore rilasciato nel sangue dal miocardio danneggiato e le sue variazioni di concentrazione riflettono la gravità dell'insufficienza cardiaca.VEGF, HGF e TGF-β sono fattori attivati ​​dal feedback durante il rimodellamento patologico ventricolare nel miocardio in fallimento.n = 3-4 topi per gruppo e * ha indicato che P <0,05.STD, gruppo di trapianto hiPS-CMs standard indotto;COMP, gruppo di trapianto hiPS-CMs indotto da compostiL'apoptosi cardiaca è stata esaminata dal test TUNEL utilizzando sezioni congelate di tessuto miocardico.In contrasto con il gruppo modello, il numero di cellule apoptotiche è diminuito significativamente dopo il trapianto di hiPS-CM indotto da composti (Fig. 5e e Fig. 8a supplementare), mentre questo fenomeno non è stato osservato nel gruppo di trapianto di hiPS-CM indotto standard a 4 settimane .Dopo l'analisi statistica quantitativa delle cellule TUNEL-positive, è stato riscontrato che il numero di cellule apoptotiche nel gruppo hiPS-CM indotto dal composto è diminuito più di quello del gruppo hiPS-CM indotto standard a 4 e 8 settimane (Fig. 5h e Fig. 8d supplementare).avv.Ing.Circo.Circo.Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.Spiacenti, un link condivisibile non è attualmente disponibile per questo articolo.