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modello di ratto POCD è stato stabilito mediante inalazione di Sevo e un modello di cellula Sevo è stato costruito in neuroni ippocampali primari isolati dai ratti, seguito dal rilevamento dell'espressione di miR-140-30 e HTR2A.Quindi, nei ratti e nei neuroni sono stati implementati saggi di guadagno e perdita di funzione.Nei ratti, la funzione cognitiva è stata valutata mediante il test del labirinto d'acqua e il test step-through e l'apoptosi dei neuroni mediante la colorazione TUNEL.Nei neuroni, la vitalità cellulare, l'apoptosi e i fattori correlati alla piroptosi sono stati testati rispettivamente mediante MTT, citometria a flusso e analisi Western blot.L'interazione tra HTR2A e DNMT1 è stata valutata mediante analisi MSP e ChIP e l'interazione tra miR-140-3p e DNMT1 mediante analisi reporter dual-luciferase, pull-down RIP e RNA.HTR2A e miR-140-3p sono stati sottoregolati nei ratti POCD e nei neuroni dell'ippocampo trattati con Sevo.Meccanicamente, miR-140-3p ha preso di mira negativamente DNMT1 per ridurre la metilazione del promotore HTR2A, quindi sovraregolazione HTR2A per attivare il percorso ERK/Nrf2.La sovraespressione di miR-140-3p o HTR2A o l'attivazione della via ERK/Nrf2 ha aumentato la vitalità dei neuroni e ha diminuito la loro apoptosi e pirotosi mentre alleviava il POCD indotto da Sevo nei ratti.Collettivamente, miR-140-3p potrebbe reprimere la piroptosi neuronale per alleviare il POCD indotto dall'inalazione di Sevo nei ratti tramite l'asse DNMT1/HTR2A/ERK/Nrf2.Il sevoflurano (Sevo) è un agente volatile per il mantenimento dell'anestesia generale clinica, che è ben tollerato per l'induzione per inalazione [1].Tuttavia, l'inalazione di Sevo può provocare apoptosi neuronale con alterazioni patologiche nell'ippocampo cerebrale, innescando un declino neurocognitivo [2, 3].La disfunzione cognitiva post-operatoria (POCD) è una complicanza neurologica legata a morbilità sostanziale e mortalità elevata e si verifica particolarmente frequentemente nelle persone anziane che hanno subito procedure chirurgiche in anestesia generale [4].Si presume che il POCD includa deficit acuti o persistenti di attenzione, concentrazione, apprendimento e memoria dopo l'intervento chirurgico [5].La pirotosi è una forma infiammatoria di morte cellulare programmata causata dalla caspasi-1/4/5/11 attivata da alcuni inflammasomi [6].La pirotosi cellulare assume un ruolo critico nella patogenesi del POCD [7].Pertanto, è di grande importanza per identificare un nuovo target terapeutico per il ripristino della funzione cognitiva per elaborare il meccanismo molecolare alla base della pirotosi cellulare nel POCD.Il recettore 2A della 5-idrossitriptamina (HTR2A) può essere orchestrato epigeneticamente attraverso la metilazione del DNA, che influisce sullo sviluppo cerebrale del bambino e sulla funzione cognitiva dell'adulto [8].Ad esempio, la metilazione dell'HTR2A è correlata agli esiti neurocomportamentali del bambino [9].Inoltre, HTR2A può esercitare effetti neuroprotettivi attivando la via della chinasi regolata dal segnale extracellulare (ERK) nel neuroblastoma [10].Inoltre, l'attivazione di ERK è stata precedentemente documentata per alleviare la disfunzione cognitiva indotta da Sevo [11].Inoltre, la downregulation del fattore 2 (Nrf2) correlato al fattore nucleare E2 è in grado di aggravare la disfunzione cognitiva durante l'invecchiamento [12].Inoltre, la metilazione del DNA di HTR2A è in grado di ridurre l'espressione di HTR2A per facilitare la disfunzione cognitiva durante lo sviluppo della schizofrenia [13].Inoltre, l'espressione della DNA metiltransferasi-1 (DNMT1) è legata alla metilazione di HTR2A [14].Come mostrato in precedenza, la sovraregolazione di DNMT1 era associata a disfunzione cognitiva indotta da sepsi nei topi [15].In particolare, la sovraregolazione del microRNA (miR)-140-3p è in grado di diminuire l'espressione di DNMT1 nelle cellule WL-2 [16].Inoltre, la sovraespressione di miR-140-3p può reprimere l'infiammazione e l'apoptosi dei neuroni trattati con deprivazione e riperfusione di ossigeno-glucosio (OGD/R) [17].In questo contesto, abbiamo ipotizzato che miR-140-3p assumesse un ruolo centrale nel POCD indotto dall'inalazione di Sevo orchestrando l'asse DNMT1/HTR2A/ERK/Nrf2.Pertanto, abbiamo condotto questa ricerca per confermare questa ipotesi, fornendo così nuove informazioni sul meccanismo alla base del POCD indotto dall'inalazione di Sevo.Per studiare l'influenza di Sevo sul POCD, ratti di 7 giorni sono stati trattati con o senza inalazione di Sevo.Quindi, il test del labirinto d'acqua è stato condotto quando i ratti di età compresa tra 6 settimane, che hanno scoperto un aumento significativo della latenza e della distanza di nuoto prima che i ratti trovassero la piattaforma nascosta nel labirinto d'acqua (Fig. 1A, B) ma i tempi di attraversamento della piattaforma e il tempo dei ratti erano nettamente ridotti speso nel quadrante target (Fig. 1C, D) dopo la modellazione POCD.Nel frattempo, il test graduale quando i ratti avevano 3 mesi hanno riportato che il tempo per i ratti POCD di rientrare nella camera oscura era notevolmente ridotto (Fig. 1E).È tempo che i topi trovino una piattaforma nascosta nel labirinto d'acqua dopo la modellazione del POCD.B Distanza di nuoto dei topi prima di trovare la piattaforma nascosta nel labirinto d'acqua dopo la modellazione POCD.C I tempi dei topi che attraversano la piattaforma nascosta nel labirinto d'acqua dopo la modellazione del POCD.D Il rapporto del tempo di residenza dei ratti sulla piattaforma nascosta del labirinto d'acqua dopo la modellazione POCD.E Il tempo per i ratti di rientrare nella camera oscura nel test step-through dopo la modellazione POCD.Colorazione F H&E (a sinistra) e colorazione TUNEL (a destra) per rilevare patologie e apoptosi nei tessuti dell'ippocampo dei ratti dopo la modellazione POCD.Analisi G Western blot per rilevare l'espressione proteica dei fattori correlati all'apoptosi neuronale e alla piroptosi nei tessuti dell'ippocampo dopo la modellazione POCD.C'erano dieci ratti in ogni gruppo.*p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 rispetto ai ratti senza inalazione di Sevo.La colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) e TUNEL ha mostrato che i livelli di danno neuronale dell'ippocampo e apoptosi aumentavano chiaramente nei ratti POCD (Fig. 1F).I risultati del Western blot hanno spiegato che l'espressione dell'apoptosi (Bax e Cleaved caspase-3) e delle proteine ​​​​correlate alla piroptosi (Cleaved caspase-1, Cleaved-GSDMD, NLRP3 e ASC) nei tessuti dell'ippocampo dei ratti POCD erano nettamente aumentate, mentre L'espressione di Bcl-2 è stata notevolmente ridotta nei tessuti dell'ippocampo di ratto (Fig. 1G).Nel complesso, la funzione cognitiva dei ratti è stata danneggiata dall'inalazione di Sevo e il modello di ratto POCD è stato stabilito con successo.Successivamente, è stato ulteriormente studiato il meccanismo del POCD nei ratti.Analizzando il set di dati di espressione genica GSE63060 dei pazienti con POCD e cercando i geni correlati al POCD (punteggio> 30) dal database GeneCards, sono stati trovati 19 geni correlati alla disfunzione cognitiva (CDG) (Fig. 2A, B).Quindi, questi CDG sono stati intersecati con gli obiettivi di Sevo previsti dal database GeneCards, che ha ottenuto tre geni target intersecati che comprendevano SOD1, MTHFR e HTR2A (Fig. 2C).RT-qPCR ha mostrato che nei ratti POCD, solo HTR2A era drasticamente sottoregolato, mentre i livelli di SOD1 e MTHFR non erano sostanzialmente modificati (Fig. 2D).Pertanto, abbiamo scelto HTR2A come oggetto di ricerca di follow-up.Una mappa di Venn dell'intersezione dei geni differenzialmente espressi in GSE63060 con CDG recuperati dal database GeneCards.B Mappe termiche di 19 CDG espressi in modo differenziale tra 104 campioni di controllo e 80 campioni POCD nel set di dati GSE63060.C Mappa di Venn dell'intersezione di 19 CDG espressi in modo differenziale con gli obiettivi di Sevo recuperati dal database GeneCards.D Il rilevamento dell'espressione di HTR2A, SOD1 e MTHFR nei tessuti dell'ippocampo di ratti dopo la modellazione POCD mediante RT-qPCR.E Il rilevamento dell'espressione proteica di HTR2A nei tessuti dell'ippocampo di ratti dopo la modellazione mediante analisi Western blot.F Il rilevamento dell'espressione di HTR2A nei tessuti dell'ippocampo di ratti dopo la modellazione mediante immunoistochimica.G RT-qPCR per rilevare l'espressione di HTR2A nei neuroni dell'ippocampo dopo il trattamento con Sevo.Analisi H Western blot per rilevare l'espressione proteica di HTR2A nei neuroni dell'ippocampo dopo il trattamento con Sevo.I RT-qPCR per rilevare l'espressione genica di HTR2A nei neuroni dell'ippocampo dopo il trattamento con sh-HTR2A o oe-HTR2A.J MTT per rilevare la vitalità dei neuroni dell'ippocampo dopo il trattamento con Sevo e/o sh-HTR2A o oe-HTR2A.K L'apoptosi dei neuroni ippocampali rilevati dalla citometria a flusso dopo il trattamento con Sevo e/o sh-HTR2A o oe-HTR2A.L Analisi Western blot per misurare l'espressione proteica dei fattori correlati all'apoptosi e alla piroptosi dopo il trattamento con Sevo e/o sh-HTR2A o oe-HTR2A.In D–H, *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001 rispetto ai ratti con POCD.In I, *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 rispetto ai neuroni trattati con Sevo + sh-NC;#p < 0,05, ##p < 0,01 e ###p < 0,001 rispetto ai neuroni trattati con Sevo + oe-NC.In J–L, *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001 rispetto ai neuroni trattati senza Sevo;#p < 0,05, ##p < 0,01 e ###p < 0,001 rispetto ai neuroni trattati con Sevo + oe-NC;&p < 0,05, &&p < 0,01 e &&&p < 0,001 rispetto ai neuroni trattati con Sevo + oe-NC.L'esperimento è stato ripetuto tre volte.Successivamente, l'analisi Western blot e i risultati dell'immunoistochimica hanno dimostrato che l'HTR2A era significativamente sottoregolato nei tessuti dell'ippocampo dei ratti POCD (Fig. 2E, F).Successivamente, i neuroni dell'ippocampo sono stati trattati con Sevo e l'analisi RT-qPCR e Western blot ha offerto dati che mostrano che l'espressione di HTR2A nei neuroni dell'ippocampo era ridotta in modo memorabile dopo il trattamento con Sevo (Fig. 2G, H).Pertanto, abbiamo scelto HTR2A come soggetto per lo studio successivo.Quindi, abbiamo esplorato come HTR2A ha influenzato la vitalità, l'apoptosi e la pirotosi dei neuroni dell'ippocampo di ratto.In primo luogo, l'efficienza di sh-HTR2A e oe-HTR2A nei neuroni dell'ippocampo è stata rilevata da RT-qPCR, che ha illustrato che l'espressione di HTR2A nei neuroni trattati con sh-HTR2A#1 o sh-HTR2A#2 è stata notevolmente ridotta, con l'espressione più bassa nei neuroni trattati con sh-HTR2A#2.Pertanto, gli esperimenti di follow-up sono stati condotti con sh-HTR2A#2 (sh-HTR2A).Inoltre, l'espressione di HTR2A nei neuroni dopo il trattamento con oe-HTR2A è stata notevolmente migliorata (Fig. 2I).Il test MTT e la citometria a flusso hanno mostrato che la vitalità dei neuroni dell'ippocampo era sorprendentemente contenuta e la loro apoptosi era memorabilmente facilitata dopo il trattamento con Sevo, che è stato promosso da un ulteriore trattamento con sh-HTR2A ma è stato negato da un ulteriore trattamento con oe-HTR2A (Fig. 2J, K).Nel frattempo, il trattamento con Sevo ha contribuito ad aumentare notevolmente l'espressione delle proteine ​​​​pro-apoptotiche Bax e Cleaved caspase-3 e proteine ​​correlate alla piroptosi, vale a dire Cleaved caspase-1, Cleaved GSDMD, NLRP3 e ASC, ma diminuita l'espressione della proteina anti-apoptotica Bcl- 2 nei neuroni dell'ippocampo di ratto;questo effetto è stato promosso da un trattamento aggiuntivo con sh-HTR2A ma è stato annullato da un trattamento aggiuntivo con oe-HTR2A (Fig. 2L).Collettivamente, il silenziamento dell'HTR2A potrebbe accelerare la vitalità e reprimere l'apoptosi e la piroptosi dei neuroni dell'ippocampo di ratto dai ratti POCD.Quindi, abbiamo accertato il meccanismo a valle di HTR2A in POCD.Inoltre, il software di bioinformatica prevedeva che HTR2A fosse coinvolto nell'orchestrazione del percorso ERK/Nrf2 (Fig. 3A).Pertanto, abbiamo ulteriormente studiato se HTR2A potesse manipolare il percorso ERK/Nrf2 in POCD.I risultati dell'analisi Western blot hanno descritto una significativa diminuzione dell'espressione della proteina Nrf2 e del livello di fosforilazione di ERK nei tessuti dell'ippocampo dei ratti POCD nonché nei neuroni dell'ippocampo con trattamento Sevo (Fig. 3B, C).Un software di bioinformatica prevedeva che HTR2A fosse coinvolto nel percorso ERK/Nrf2.B Analisi Western blot dell'espressione proteica di Nrf2 e del rapporto di espressione della proteina ERK fosforilata/ERK totale nei tessuti dell'ippocampo (10 ratti/gruppo, * p < 0, 05, ** p < 0, 01 e *** p < 0, 001 vs. i ratti senza inalazione di Sevo).C Western blot per determinare l'espressione proteica di e Nrf2 e il rapporto di espressione della proteina ERK fosforilata/ERK totale nei neuroni dell'ippocampo di ratto (l'esperimento è stato ripetuto tre volte; * p < 0, 05, ** p < 0, 01 e *** p < 0, 001 contro i ratti senza inalazione di Sevo).D L'espressione proteica di HTR2A e Nrf2 e il rapporto di espressione della proteina ERK fosforilata/ERK totale nei neuroni dell'ippocampo di ratto mediante analisi Western blot (l'esperimento è stato ripetuto tre volte; * p < 0, 05, ** p < 0, 01 e *** p < 0,001 rispetto ai neuroni trattati con oe-NC; #p < 0,05, ##p < 0,01 e ###p < 0,001 rispetto ai neuroni trattati con oe-HTR2A).Successivamente, HTR2A è stato sovraespresso nei neuroni dell'ippocampo ed è stato aggiunto l'inibitore del percorso ERK/Nrf2 ML385.L'espressione proteica di HTR2A e Nrf2 e il livello di fosforilazione di ERK nei neuroni dell'ippocampo erano chiaramente aumentati dopo il trattamento con oe-HTR2A, mentre in presenza o assenza di oe-HTR2A, il trattamento con ML385 non ha influenzato l'espressione della proteina HTR2A nei neuroni dell'ippocampo, ma in modo netto ridotto l'espressione della proteina Nrf2 e il livello di fosforilazione di ERK (Fig. 3D).In conclusione, il percorso ERK/Nrf2 è stato bloccato nei ratti POCD mentre HTR2A lo ha attivato nei ratti POCD.Successivamente, il focus della nostra ricerca è stato spostato sul meccanismo a monte di HTR2A in POCD.Dai dati GSE63060, abbiamo scoperto che DNMT1 era altamente espresso nei pazienti con POCD (Fig. 4A).Il database di Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA) ha manifestato che l'espressione DNMT1 e HTR2A condivideva una correlazione negativa nei dati del tessuto cerebrale dell'espressione del genotipo-tessuto (GTEx) (Fig. 4B).Pertanto, abbiamo ipotizzato che DNMT1 potrebbe mediare l'espressione di HTR2A promuovendo la metilazione del promotore di HTR2A.A Espressione di DNMT1 nei campioni POCD di GSE63060 (104 campioni di controllo e 80 campioni POCD, *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001 rispetto ai campioni di controllo).B Database GEPIA per analizzare l'espressione di DNMT1 e HTR2A nel tessuto cerebrale di GTEx.C Rilevamento dell'espressione del gene DNMT1 nei tessuti dell'ippocampo di ratti dopo la modellazione POCD mediante RT-qPCR (* p < 0, 05, ** p < 0, 01 e *** p < 0, 001 rispetto ai ratti senza POCD).D Analisi Western blot dell'espressione proteica di DNMT1 nei tessuti dell'ippocampo dei ratti dopo la modellazione POCD (* p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001 rispetto ai ratti senza POCD).E Rilevazione dell'espressione del gene DNMT1 nei neuroni dell'ippocampo di ratto dopo il trattamento con Sevo mediante RT-qPCR (*p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001 rispetto ai neuroni senza trattamento con Sevo).F Analisi Western blot per rilevare l'espressione proteica di DNMT1 nei neuroni dell'ippocampo di ratto dopo il trattamento con Sevo (* p < 0, 05, ** p < 0, 01 e *** p < 0, 001 rispetto ai neuroni senza trattamento con Sevo).G MSP per misurare il livello di metilazione del promotore HTR2A nei neuroni dell'ippocampo dopo il trattamento con Sevo.H RT-qPCR per determinare l'espressione del gene DNMT1 nei neuroni dell'ippocampo dopo il trattamento con sh-DNMT1 o oe-DNMT1 (* p < 0, 05, ** p < 0, 01 e *** p < 0, 001 rispetto ai neuroni trattati con sh- NC; #p <0,05, ##p <0,01 e ###p <0,001 rispetto ai neuroni trattati con oe-NC).I Rilevazione dell'arricchimento di DNMT1 nel promotore HTR2A mediante saggio ChIP dopo il trattamento con sh-DNMT1 o oe-DNMT1.J MSP per rilevare il livello di metilazione del promotore HTR2A nei neuroni dell'ippocampo dopo il trattamento con sh-DNMT1 o oe-DNMT1.K RT-qPCR per rilevare l'espressione genica di HTR2A nei neuroni dell'ippocampo dopo il trattamento con sh-DNMT1 o oe-DNMT1.L Analisi Western blot per rilevare l'espressione proteica di DNMT1 e HTR2A nei neuroni dell'ippocampo dopo il trattamento con sh-DNMT1 o oe-DNMT1.In I, K e L, * p < 0, 05, ** p < 0, 01 e *** p < 0, 001 rispetto ai neuroni trattati con sh-NC;#p < 0,05, ##p < 0,01 e ###p < 0,001 rispetto ai neuroni trattati con oe-NC.L'esperimento cellulare è stato ripetuto tre volte.Come riflesso dai dati RT-qPCR e Western blot, l'espressione di DNMT1 nei tessuti dell'ippocampo dei ratti POCD è aumentata notevolmente (Fig. 4C, D).È stato rilevato un aumento consistente nei neuroni ippocampali primari di ratto trattati con Sevo (Fig. 4E, F).Successivamente, MSP ha dimostrato che dopo il trattamento con Sevo, il livello di metilazione dell'isola CpG nella regione del promotore HTR2A nei neuroni dell'ippocampo era notevolmente elevato (Fig. 4G).Successivamente, l'efficienza di sh-DNMT1 e oe-DNMT1 nei neuroni ippocampali primari di ratto è stata rilevata da RT-qPCR, che ha dimostrato che l'espressione di DNMT1 era significativamente ridotta da sh-DNMT1 # 1 o sh-DNMT1 # 2, in particolare sh-DNMT1 # 2;pertanto, sh-DNMT1#2 (sh-DNMT1) è stato selezionato per la successiva sperimentazione.Inoltre, l'espressione di DNMT1 è stata ovviamente migliorata da oe-DNMT1 (Fig. 4H).Inoltre, il test ChIP ha mostrato che il livello di arricchimento di DNMT1 nella regione del promotore HTR2A era potentemente diminuito dal trattamento con sh-DNMT1, che era contrario dopo il trattamento con oe-DNMT1 (Fig. 4I).Quindi il risultato MSP ha documentato che il livello di metilazione del promotore HTR2A è diminuito in modo osservabile dopo il trattamento con sh-DNMT1, mentre il risultato opposto è stato osservato dopo il trattamento con oe-DNMT1 (Fig. 4J).Come indicato dai risultati dell'analisi RT-qPCR e Western blot, l'espressione di HTR2A è stata notevolmente migliorata dopo il trattamento con sh-DNMT1, che era opposto dopo il trattamento con oe-DNMT1 (Fig. 4K, L).In conclusione, DNMT1 era altamente espresso nei ratti POCD e potrebbe promuovere la metilazione di HTR2A e inibirne la trascrizione nei neuroni ippocampali dei ratti POCD.Al fine di esplorare ulteriormente se DNMT1 può essere preso di mira dai miRNA, i miRNA che prendono di mira DNMT1 sono stati previsti dal database Encyclopedia of RNA Interactomes (ENCORI) e sono stati intersecati con il set di dati di espressione di miRNA correlato a POCD (GSE95070), rivelando miR-140-3p nel intersezione e la mappa di calore ha mostrato la downregulation di miR-140-3p nei campioni POCD (Fig. 5A, B).Come indicato da RT-qPCR, l'espressione di miR-140-3p è stata potentemente ridotta sia nei tessuti ippocampali dei ratti POCD che nei neuroni ippocampali indotti da Sevo (Fig. 5C, D).A La mappa termica che mostra una bassa espressione di miR-140-3p in GSE95070 nei campioni POCD.B Mappa di Venn dell'intersezione dei miRNA previsti che prendono di mira DNMT1 nel database ENCORI8 con i miRNA differenzialmente espressi in GSE95070.C Il rilevamento dell'espressione di miR-140-3p nei tessuti dell'ippocampo di ratti dopo la modellazione POCD mediante RT-qPCR (c'erano dieci ratti in ciascun gruppo. *p <0,05, **p <0,01 e ***p < 0,001 contro i ratti senza POCD).D Il rilevamento dell'espressione di miR-140-3p nei neuroni dell'ippocampo dopo il trattamento con Sevo mediante RT-qPCR (l'esperimento è stato ripetuto tre volte; * p < 0, 05, ** p < 0, 01 e *** p < 0, 001 rispetto al neuroni di controllo).E La previsione dei siti di legame di miR-140-3p e DNMT1 dal database ENCORI.F Saggio reporter della doppia luciferasi per valutare il legame mirato di miR-140-3p e DNMT1 (l'esperimento è stato ripetuto tre volte; * p < 0, 05, ** p < 0, 01 e *** p < 0, 001 rispetto al trattamento mimico NC ).G Il rilevamento dell'interazione tra miR-140-3p e DNMT1 mediante saggio RIP (l'esperimento è stato ripetuto tre volte; * p < 0, 05, ** p < 0, 01 e *** p < 0, 001 rispetto al trattamento mimico NC).H L'analisi dell'interazione tra miR-140-3p e DNMT1 mediante RNA pull-down (l'esperimento è stato ripetuto tre volte; *p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001 vs. Bio-DNMT1- MUT e Bio-probeNC).I Il rilevamento dell'espressione di miR-140-3p e DNMT1 nei neuroni dell'ippocampo dopo il trattamento mimico o inibitore di miR-140-3p mediante RT-qPCR.J Analisi Western blot per rilevare l'espressione proteica di DNMT1 nei neuroni dell'ippocampo dopo il trattamento mimico o inibitore del miR-140-3p.In I, J, l'esperimento è stato ripetuto tre volte;*p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 rispetto ai neuroni trattati con NC mimica, #p < 0,05, ##p < 0,05 e ###p < 0,05 rispetto ai neuroni trattati con inibitore NC.Abbiamo ulteriormente studiato se miR-140-3p potesse orchestrare direttamente l'espressione DNMT1.In primo luogo, i siti di legame tra miR-140-3p e DNMT1 sono stati ottenuti dal database ENCORI (Fig. 5E).Successivamente, il test reporter della doppia luciferasi ha mostrato che l'attività della luciferasi delle cellule con DNMT1-WT è stata nettamente ridotta dal miR-140-3p mimic, mentre quella delle cellule con DNMT1-MUT è rimasta quasi invariata (Fig. 5F), il che ha suggerito che miR -140-3p potrebbe prendere di mira DNMT1.I risultati del RIP hanno mostrato che l'arricchimento di DNMT1 nei campioni abbattuti da AGO2 era notevolmente aumentato dopo il guadagno di funzione di miR-140-3p (Fig. 5G), il che indicava che miR-140-3p potrebbe interagire con DNMT1.Il test di pull-down dell'RNA ha anche descritto che l'espressione di miR-140-3p è stata chiaramente migliorata da Bio-DNMT1-WT (Fig. 5H).Successivamente, abbiamo ulteriormente studiato la regolazione di DNMT1 da parte di miR-140-3p.I risultati di RT-qPCR e Western blot hanno illustrato che l'espressione di miR-140-3p era notevolmente aumentata dopo il trattamento con miR-140-3p mimic, mentre l'espressione di DNMT1 era notevolmente ridotta, che era opposta all'inibizione di miR-140-3p (Fig. 5I, J).In breve, miR-140-3p era sottoespresso nei ratti POCD e potrebbe mirare a DNMT1 nei neuroni ippocampali dei ratti POCD.Successivamente, abbiamo ulteriormente esplorato se miR-140-3p potesse modulare la vitalità, l'apoptosi e la piroptosi dei neuroni dell'ippocampo attraverso l'asse DNMT1/HTR2A/ERK/Nrf2.Attraverso le analisi RT-qPCR e Western blot, l'espressione di miR-140-3p, HTR2A e Nrf2 e il livello di fosforilazione di ERK nei neuroni dell'ippocampo di ratto trattati con Sevo sono stati notevolmente aumentati mentre quello di DNMT1 era evidentemente diminuito dopo miR- Trattamento mimico 140-3p.Tuttavia, in presenza di mimic-NC o miR-140-3p mimic, non è stata notata alcuna differenza significativa per quanto riguarda l'espressione di miR-140-3p, DNMT1 e HTR2A nei neuroni dell'ippocampo di ratto indotti da Sevo dopo il trattamento con ML385, ma il il livello di fosforilazione dell'espressione di ERK e Nrf2 è diminuito sostanzialmente (Fig. 6A, B).I neuroni dell'ippocampo sono stati trasdotti con mimic NC, miR-140-3p, mimic NC + ML385 o miR-140-3p + ML385.A Il rilevamento dell'espressione di miR-140-3p, DNMT1, HTR2A e Nrf2 nei neuroni dell'ippocampo mediante RT-qPCR.B Il rilevamento dell'espressione proteica di DNMT1, HTR2A e Nrf2 e del rapporto di espressione della proteina ERK fosforilata/ERK totale nei neuroni dell'ippocampo mediante analisi Western blot.C MTT per rilevare la vitalità cellulare dei neuroni dell'ippocampo.D L'apoptosi dei neuroni dell'ippocampo determinata mediante citometria a flusso.E Analisi Western blot per rilevare l'espressione proteica di fattori apoptotici e pirolitici nei neuroni dell'ippocampo.L'esperimento è stato ripetuto tre volte.*p <0,05, **p <0,01 e ***p <0,001 rispetto ai neuroni trattati con NC mimica;#p < 0,05, ##p < 0,01 e ###p < 0,001 rispetto ai neuroni trattati con miR-140-3p mimic.MTT e citometria a flusso hanno documentato che il trattamento con ML385 ha comportato un declino della vitalità cellulare e un aumento dell'apoptosi cellulare dei neuroni dell'ippocampo indotti da Sevo.Dopo il trattamento mimico con miR-140-3p, la vitalità dei neuroni ippocampali indotti da Sevo è stata notevolmente migliorata e la loro apoptosi è stata significativamente ridotta, che è stata annullata da un ulteriore trattamento con ML385 (Fig. 6C, D).Inoltre, i risultati dell'analisi Western blot dei fattori correlati all'apoptosi e alla piroptosi nei neuroni dell'ippocampo indotti da Sevo erano concordanti con quelli della citometria a flusso (Fig. 6E).In sintesi, miR-140-3p potrebbe regolare l'asse DNMT1/HTR2A/ERK/Nrf2 per aumentare la vitalità e ridurre l'apoptosi e la pirotosi dei neuroni dell'ippocampo.Infine, abbiamo ulteriormente esplorato se miR-140-3p potrebbe influenzare il POCD indotto da Sevo tramite l'asse DNMT1/HTR2A/ERK/Nrf2 in vivo.L'analisi RT-qPCR e Western blot ha indicato che dopo il trattamento mimico con miR-140-3p, l'espressione di miR-140-3p, HTR2A e Nrf2, nonché il livello di fosforilazione di ERK è notevolmente aumentato nei tessuti dell'ippocampo dei ratti POCD mentre l'espressione di DNMT1 è diminuita in modo sorprendente .Nessuna differenza significativa nell'espressione di miR-140-3p, DNMT1 e HTR2A, ma evidenti declini dell'espressione di Nrf2 e del livello di fosforilazione di ERK sono stati rilevati nei tessuti dell'ippocampo di ratti POCD dopo il trattamento con ML385 in presenza di NC mimico o miR-140-3p mimico ( Fig. 7A, B).I ratti POCD sono stati trattati con mimic NC, miR-140-3p, mimic NC + ML385 o miR-140-3p + ML385.A Il rilevamento dell'espressione di miR-140-3p, DNMT1, HTR2A e Nrf2 nei tessuti dell'ippocampo di ratti mediante RT-qPCR.B Il rilevamento dei livelli proteici di DNMT1, HTR2A e Nrf2 e del rapporto di espressione della proteina ERK fosforilata/ERK totale attraverso l'analisi Western blot.C È ora che i topi trovino una piattaforma nascosta nel labirinto d'acqua.D Distanza di nuoto dei topi prima di trovare la piattaforma nascosta nel labirinto d'acqua.E I tempi dei topi che attraversano la piattaforma nascosta nel labirinto d'acqua.F Il rapporto del tempo di residenza dei topi sulla piattaforma nascosta del labirinto d'acqua.G Il tempo per i ratti di rientrare nella camera oscura nel test step-through.Colorazione H H&E per determinare i cambiamenti patologici dei tessuti dell'ippocampo.Colorazione I TUNEL per rilevare l'apoptosi dei neuroni dell'ippocampo nei ratti.J Analisi Western blot per rilevare l'espressione proteica di fattori correlati all'apoptosi e alla piroptosi nei tessuti dell'ippocampo dei ratti.C'erano dieci ratti in ogni gruppo.*p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001 rispetto ai ratti trattati con NC mimica;#p < 0,05, ##p < 0,01 e ###p < 0,001 rispetto ai ratti trattati con miR-140-3p mimic.Successivamente, i risultati dell'esperimento del labirinto d'acqua hanno mostrato che prima di trovare la piattaforma nascosta nel labirinto d'acqua, la latenza e la distanza di nuoto dei ratti POCD trattati con miR-140-3p mimic erano nettamente ridotte e i tempi di attraversamento della piattaforma e il tempo le spese nel quadrante target sono state aumentate in modo memorabile mentre il trattamento ML385 ha innescato tendenze opposte;l'effetto del mimico miR-140-3p è stato annullato dal trattamento ML385 (Fig. 7C-F).Successivamente, il tempo dei ratti POCD trattati con miR-140-3p mimic prima di rientrare nella camera oscura è stato ovviamente aumentato, mentre quello dei ratti POCD prima di rientrare nella camera oscura è stato chiaramente diminuito di ML385 in presenza di NC mimic o imitazione miR-140-3p (Fig. 7G).Ulteriori risultati di H&E, colorazione TUNEL e analisi Western blot hanno presentato che il danno neuronale dell'ippocampo, l'apoptosi e la piroptosi dei ratti POCD erano drasticamente ridotti dal mimico miR-140-3p ma erano evidentemente elevati dopo il trattamento con ML385;mentre l'impatto indotto dal mimic miR-140-3p è stato abrogato dal trattamento ML385 (Fig. 7H-J).Presi insieme, miR-140-3p potrebbe alleviare il POCD causato da Sevo nei ratti tramite l'asse DNMT1/HTR2A/ERK/Nrf2.Il POCD influenza negativamente la funzione cognitiva soggettiva e la qualità della vita nei pazienti affetti e facilita anche il rischio di demenza e mortalità [18].Inoltre, l'incidenza del POCD è in costante aumento nei pazienti più anziani dopo l'intervento chirurgico, in particolare nei pazienti che ricevono l'anestesia con Sevo [19].miR-140-3p ha dimostrato di essere alterato nel cancro al seno, nel carcinoma epatocellulare, nel carcinoma polmonare e nel cordoma spinale [20].Tuttavia, la funzionalità di miR-140-3p in POCD è rimasta enigmatica.Sulla base di ciò, la nostra ricerca mirava a capire se miR-140-3p ha orchestrato il POCD indotto dall'inalazione di Sevo e il potenziale meccanismo.I nostri dati hanno rivelato che miR-140-3p potrebbe mirare inversamente a DNMT1 per inibire la metilazione del promotore HTR2A e promuovere la trascrizione di HTR2A, attivando così il percorso ERK/Nrf2 e quindi alleviando il POCD indotto da Sevo nei ratti.In primo luogo, abbiamo osservato che HTR2A era scarsamente espresso nei tessuti dell'ippocampo dei ratti POCD.È stato riconosciuto che l'HTR2A svolge un ruolo cruciale nell'orchestrazione dei disturbi neurologici, quindi i suoi agonisti hanno un potenziale terapeutico nei disturbi neurologici [21].Ad esempio, la ricerca di Hasselbalch et al.ha scoperto che la downregulation di HTR2A partecipava a una lieve disfunzione cognitiva nella malattia di Alzheimer [22].Inoltre, un'altra ricerca ha dimostrato che l'attivazione di HTR2A potrebbe attenuare la disfunzione cognitiva nei ratti emiparkinsoniani [23].Pertanto, questi risultati hanno suggerito che la sovraespressione di HTR2A potrebbe essere associata all'alleviamento del POCD indotto da Sevo.Ulteriori dati nel nostro lavoro hanno mostrato che HTR2A aumentava la vitalità e diminuiva l'apoptosi e la pirotosi dei neuroni dell'ippocampo dai ratti POCD.Risultati corroboranti sono stati riportati in un lavoro precedente che l'agonista HTR2A (TCB-2) ha diminuito l'apoptosi neuronale indotta da streptozotocina nell'ippocampo dei ratti [24].Tuttavia, finora ci sono state poche ricerche sul ruolo di HTR2A nella pirotosi cellulare.Inoltre, abbiamo anche scoperto che la sovraregolazione di HTR2A limitava l'espressione dei geni correlati alla pirotosi (Cleaved-GSDMD, NLRP3 e ASC) nei neuroni dell'ippocampo di ratti POCD.Come componente critico dell'inflammasoma NLRP3, GSDMD è coinvolto nell'attivazione dell'inflammasoma NLRP3 e subisce la scissione proteolitica da parte della caspasi-1 per secernere il suo frammento N-terminale, che a sua volta modula la pirotosi [25].Cleaved-GSDMD forma i pori della membrana con conseguente rilascio di citochine e/o morte programmata delle cellule litiche, chiamata pirotosi [26].Inoltre, l'ASC funge da acceleratore della pirotosi cellulare [27].Cumulativamente, la sovraregolazione di HTR2A ha contribuito alla soppressione dell'apoptosi e della piroptosi dei neuroni per alleviare il POCD indotto da Sevo nei ratti.Inoltre, è stato precedentemente riportato che HTR2A ha attivato la via ERK per aumentare la proliferazione dei progenitori basali [28].Coerentemente, abbiamo svelato che la sovraespressione di HTR2A aumentava la vitalità e riduceva l'apoptosi e la piroptosi dei neuroni dell'ippocampo da ratti POCD attivando il percorso ERK/Nrf2.L'attivazione del percorso ERK agisce per alleviare la disfunzione cognitiva indotta dall'anestesia migliorando la sopravvivenza dei neuroni e l'apoptosi dei neuroni [29].Inoltre, l'attivazione del percorso Nrf2 deprime la disfunzione cognitiva causata da Aβ1-42 nei topi [30].Nel frattempo, la disfunzione cognitiva indotta dall'ipoperfusione cerebrale cronica nei ratti può essere soppressa attivando la via ERK/Nrf2 [31].In accordo con i nostri risultati, è stato notato in ricerche precedenti che la sovraregolazione del percorso ERK/Nrf2 ha innescato la soppressione dell'apoptosi neuronale nell'ippocampo per migliorare la disfunzione cognitiva indotta dall'ipoperfusione cerebrale cronica nei ratti [32].Curiosamente, l'attivazione della via Nrf2 può portare all'inibizione della piroptosi cellulare in un modello murino di danno da ischemia-riperfusione renale, accompagnata da ridotta espressione di ASC, caspasi-1 e GSDMD [33].In particolare, il lavoro di Li et al.ha manifestato che la sovraregolazione del percorso ERK/Nrf2 era in grado di ridurre la piroptosi e l'apoptosi dei neuroni esposti a Sevo [34], il che era in concomitanza con i nostri risultati.Esistono numerosi dati che dimostrano che la metilazione dell'HTR2A assume un ruolo fondamentale nello sviluppo cerebrale del feto e nella funzione cognitiva dell'adulto [8].Nella nostra ricerca, la metilazione del promotore HTR2A è stata osservata nel POCD attivato da Sevo nei ratti e il miR-140-3p ha preso di mira negativamente il DNMT1 per ridurre la metilazione dell'HTR2A, sovraregolando così l'HTR2A per aumentare la vitalità e diminuire l'apoptosi e la piroptosi dei neuroni dell'ippocampo dai ratti POCD .Allo stesso modo, è stato chiarito che la sovraespressione di DNMT1 provoca la metilazione del promotore HTR2A nelle cellule di mieloma [14] e che la sovraespressione di miR-140-3p è collegata al declino dell'espressione di DNMT1 nelle cellule WL-2 [16].Inoltre, un lavoro precedente ha scoperto che la sovraregolazione di DNMT1 era coinvolta nella disfunzione cognitiva indotta dalla carenza di zinco nei ratti [35].Inoltre, la sovraespressione di miR-140-3p protegge i neuroni dall'apoptosi dopo l'induzione di OGD/R [17].Biochim Biophys Acta.