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delle cellule epiteliali del colon in vitro erano con lipopolisaccaride (LPS) per la determinazione delle espressioni MTA1 e HIF1A.È stato riscontrato che MTA1 e HIF1A erano entrambi altamente espressi in campioni di colite sperimentale.I risultati del test del gene reporter della doppia luciferasi e del test ChIP hanno inoltre rivelato che MTA1 ha attivato HIF1A e successivamente ha indotto la trascrizione di AQP4 per sovraregolare AQP4 nella colite sperimentale.Dopo la funzione di perdita e guadagno, gli effetti dell'asse MTA1/HIF1A/AQP4 sull'apoptosi e sulla vitalità delle cellule epiteliali del colon sono stati rilevati da una combinazione di colorazione TUNEL e citometria a flusso e test CCK-8.È stato osservato che il silenziamento di MAT1 nelle cellule FHC e NCM460 riduceva le espressioni di IL-1β e TNF-α indotte da LPS.Nel frattempo, AQP4 ha promosso l'infiammazione indotta da LPS e ha esacerbato l'apoptosi delle cellule epiteliali del colon e ha aumentato lo sviluppo della colite sperimentale nei topi.Esperimenti in vivo hanno inoltre verificato che il trattamento con TGN-020 alleviava efficacemente la colite sperimentale indotta da DSS nei topi e riduceva l'apoptosi delle cellule epiteliali del colon.Complessivamente, MTA1 può promuovere la trascrizione di AQP4 attivando HIF1A, esacerbando così la colite sperimentale indotta da DSS nei topi, che fornisce una nuova direzione per il trattamento della colite sperimentale.La colite acuta e cronica sono condizioni infiammatorie episodiche che colpiscono milioni di persone in tutto il mondo [1].Inoltre, la patogenesi della progressione della colite non è caratterizzata in modo completo;nel frattempo, ci sono state crescenti speculazioni sul ruolo dell'ecosistema del microbiota gastrointestinale nella colite [2].Attualmente, la colite infettiva acuta viene trattata clinicamente con l'uso di antimicrobici [3].Al contrario, diversi tipi di colite, come la colite ulcerosa, possono essere molto refrattari.Gli ultimi decenni hanno assistito all'avvento dei prodotti biologici (prodotti biologici), che sono catene complesse di aminoacidi, zuccheri o acidi nucleici, tra cui proteine ​​terapeutiche, anticorpi monoclonali, sangue e derivati ​​del sangue.Inoltre, i farmaci biologici hanno anche trovato ampio uso nel trattamento della colite ulcerosa.Tuttavia, l'uso di prodotti biologici è accompagnato da immensi costi sanitari, mentre l'adozione di biosimilari ha anche mostrato un grande potenziale nel trattamento di queste malattie [4].La proteina 1 associata alla metastasi (MTA1) è ben nota come modificatore della cromatina con un notevole coinvolgimento nella prognosi di numerose neoplasie maligne [5].Inoltre, le prove esistenti suggeriscono ulteriormente che MTA1 svolge un ruolo regolatorio nella proliferazione e metastasi delle cellule del cancro del colon-retto [6].Inoltre, MTA1 conferisce effetti anche sulla regolazione delle risposte infiammatorie e delle infezioni [7].Tuttavia, il meccanismo potenziale e specifico di MTA1 nella colite sperimentale rimane attualmente sfuggente.Tuttavia, è noto che la sovraespressione di MTA1 facilita l'espressione del fattore 1 A inducibile dall'ipossia (HIF1A) nelle cellule di cancro del polmone umano non a piccole cellule [8].HIF1 è considerato un fattore di trascrizione eterodimerico, che può fungere da mediatore delle risposte adattative all'ipossia [9].È anche interessante notare che uno studio esistente ha identificato che l'attivazione di HIF1A nelle cellule mieloidi potrebbe facilitare lo sviluppo di colite indotta da destrano solfato sodico (DSS) nei topi, che è la base per la colite sperimentale [10].Inoltre, HIF1A stabilizzato da CoCl2 è stato precedentemente scoperto per elevare i livelli di acquaporina 4 (AQP4) nella placenta umana [11].L'acquaporina 4 (AQP4) è considerata un tipo di proteina transmembrana originaria della famiglia delle acquaporina e funge inoltre da canale d'acqua vitale nel cervello dei mammiferi [12].Come riportato in precedenza, la carenza di AQP4 può facilitare l'attenuazione della colite sperimentale nei modelli murini [13].Alla luce della suddetta letteratura, abbiamo ipotizzato che MTA1 potesse potenzialmente influenzare lo sviluppo della colite sperimentale con regolazione dell'asse HIF1A/AQP4 e successivamente abbiamo eseguito una serie di esperimenti per validare lo stesso, nel tentativo di scoprire nuove modalità diagnostiche e terapeutiche contro colite sperimentale.Dopo che la colite sperimentale è stata indotta nei topi con DSS al 2%, i risultati hanno illustrato una notevole riduzione del peso dei topi (Fig. 1A), accompagnata da diarrea e feci sanguinolente.Dopo l'eutanasia, è stato isolato il colon completo dei topi ed è stato osservato che il colon dei topi trattati con DSS al 2% era più corto rispetto a quello dei topi di controllo (Fig. 1B).La colorazione HE ha anche mostrato un evidente ispessimento della parete del colon nei topi trattati con DSS al 2%, insieme a una grave infiltrazione di cellule infiammatorie (Fig. 1C).L'analisi immunoistochimica ha ulteriormente dimostrato che, rispetto al controllo, la concentrazione di cellule CD45 positive era aumentata nel tessuto del colon dei topi trattati con DSS al 2% (Fig. 1D).A L'analisi statistica per il peso corporeo di 30 giorni di topi di controllo e 2% di topi trattati con DSS.B Statistiche per la lunghezza del colon di topi di controllo e 2% di topi indotti da DSS.*p < 0,05 rispetto al gruppo di controllo.Colorazione C HE dei tessuti del colon trasversali nei topi (200 ×).D Rilevamento del tasso cellulare positivo per CD45 nei tessuti del colon di topi.I dati di misurazione sono stati espressi come media ± deviazione standard.I dati tra due gruppi sono stati confrontati con il test t di studenti spaiati e i dati in diversi punti temporali sono stati confrontati con misure ripetute ANOVA, seguite dai test post hoc di Tukey.n = 8. ***p < 0,001.Abbiamo analizzato il set di dati di espressione genica della colite sperimentale GSE53835 e abbiamo scoperto che MTA1 era altamente espresso nella colite sperimentale (Fig. 2A).I livelli di mRNA e proteine ​​di MTA1 sono aumentati dopo il trattamento con DSS del 2% nei tessuti del colon (Fig. 2B, C; Fig. 1A supplementare).In modo coerente, MTA1 è stato sovraregolato dopo il trattamento con lipopolisaccaridi (LPS) nelle cellule FHC (Fig. 2E, F; Fig. 1B supplementare), insieme all'interleuchina sovraregolata (IL) -1β e al fattore di necrosi tumorale (TNF) -α (Fig. 2D).A Il modello di espressione di MTA1 nei campioni di controllo (riquadro blu) e colite sperimentale (riquadro rosso) nel set di dati GSE53835.B Il pattern di espressione dell'mRNA di MTA1 nei tessuti di topi di controllo e il 2% di topi trattati con DSS analizzati mediante RT-qPCR, n = 8. C Il pattern di espressione della proteina di MTA1 nei tessuti di topi di controllo e il 2% di topi trattati con DSS rilevati da western blot, n = 8. D RT-qPCR per rilevare i modelli di espressione dell'mRNA di IL-1β e TNF-α nelle cellule FHC dopo il trattamento con LPS.E Il pattern di espressione proteica di MTA1 rilevato mediante western blot.F Il pattern di espressione dell'mRNA di MTA1 rilevato da RT-qPCR.G RT-qPCR per rilevare l'efficienza di silenziamento sh-MTA1 nelle cellule FHC.H Il pattern di espressione di MTA1, IL-1β e TNF-α in cellule FHC trattate con LPS determinato con RT-qPCR.**p < 0,01;***p < 0,001.I dati di misurazione sono stati espressi come media ± deviazione standard.I dati tra due gruppi sono stati confrontati dal test t dello studente spaiato e i dati tra più gruppi sono stati confrontati dall'ANOVA unidirezionale, seguito dai test post hoc di Tukey.L'esperimento è stato condotto tre volte indipendentemente.Successivamente, abbiamo adottato sh-MTA1 # 1 e sh-MTA1 # 2 per silenziare MTA1 nelle cellule FHC epiteliali del colon normale umano.I due RNA indipendenti a forcina corta (shRNA) hanno raggiunto una buona efficienza di silenziamento, mentre MTA1#1 ha mostrato un'efficienza di silenziamento superiore e quindi è stato adottato per la successiva sperimentazione (Fig. 2G).Dopo il trattamento con LPS, non ci sono state alterazioni nei livelli di IL-1β e TNF-α in risposta a sh-MTA1#1 e sh-MTA1#2 (Fig. 2H).Nel frattempo, la sperimentazione identica con l'epitelio del colon normale umano NCM460 ha manifestato risultati simili (Figura 2A-E supplementare).Inoltre, le analisi di GSE53835 hanno indicato che HIF1A era sovraespresso (Fig. 3A), mentre l'analisi di co-espressione di MEM ha mostrato che MTA1 e HIF1A erano entrambi marcatamente co-espressi e condividevano una correlazione positiva (Fig. 3B) nella colite sperimentale.Nel frattempo, il trattamento DSS potrebbe elevare radicalmente l'espressione di HIF1A nei tessuti del colon, mentre il trattamento con LPS ha anche migliorato l'espressione di HIF1A nelle cellule FHC (Fig. 3C, D; Fig. 1C, D supplementare).Inoltre, il silenziamento di MTA1 ha ridotto la sovraregolazione di HIF1A nelle cellule FHC indotte da LPS (Fig. 3E; Fig. 1E supplementare).A Il modello di espressione di HIF1A nel campione di controllo (riquadro blu) e nel campione sperimentale di colite (riquadro rosso) nel set di dati GSE53835.B La relazione di co-espressione tra MTA1 e HIF1A in ciascun set di dati analizzato da MEM.(La linea HIF1A nel grafico era principalmente rossa, indicando che si trattava principalmente di una correlazione positiva).C Western blot per rilevare l'espressione proteica di HIF1A nei tessuti del colon dopo colite sperimentale indotta da DSS nei topi, n = 8. D Il pattern di espressione proteica di HIF1A nelle cellule FHC indotte da LPS rilevate da western blot.E Il pattern di espressione proteica di HIF1A in cellule FHC silenziate MTA1 trattate con LPS rilevate mediante western blot.F Il gene di interazione di AQP4 è stato ottenuto da GeneCards ed è stata costruita la rete di interazione.(Il colore rosso del cerchio del gene suggeriva che il grado centrale del gene nella rete fosse più alto; altrimenti, più il gene era blu, più basso era il livello di espressione della proteina).G Il pattern di espressione di AQP4 è stato rilevato mediante western blot dopo che le cellule FHC silenziate con MTA1 sono state trattate con LPS.H Diagramma schematico del sito di legame di HIF1A e AQP4.I Saggio del gene reporter della doppia luciferasi di correlazione tra MTA1 e HIF1A.J Convalida RT-qPCR dell'efficienza di sovraespressione del plasmide di sovraespressione MTA1 nelle cellule FHC.K L'effetto della sovraespressione di MTA1 nell'arricchimento di HIF1A nella regione del promotore di AQP4 determinato con il test ChIP.**p < 0,01;***p < 0,001.I dati di misurazione sono stati espressi come media ± deviazione standard.I dati tra due gruppi sono stati confrontati dal test t dello studente spaiato e i dati tra più gruppi sono stati confrontati dall'ANOVA unidirezionale, seguito dai test post hoc di Tukey.L'esperimento è stato condotto tre volte indipendentemente.Successivamente abbiamo analizzato la rete di interazione di AQP4 utilizzando il database GeneCards e identificato 25 geni interagenti (Fig. 3F).Con KOBAS per arricchire il percorso KEGG, abbiamo inoltre rilevato che i primi cinque percorsi arricchiti di AQP4 e dei suoi geni di interazione erano mitofagia-animale, giunzione aderente, espressione di PD-L1 e percorso del punto di controllo PD-1 nel cancro, regolazione del mediatore infiammatorio dei canali TRP, Via di segnalazione NF kappa B (Tabella 1 supplementare).Inoltre, gli studi esistenti hanno anche determinato l'associazione di questi percorsi con l'infiammazione [14,15,16,17,18].I risultati successivi hanno mostrato che LPS ha elevato l'espressione di AQP4, mentre un ulteriore silenziamento di MTA1 ha inibito l'espressione di AQP4 nelle cellule FHC (Fig. 3G; Fig. 1F supplementare).Come previsto dal database hTFtarget, il sito di legame di HIF1A è stato identificato nel promotore AQP4 (Fig. 3H).Inoltre, dopo la co-trasfezione della sovraespressione di HIF1A con AQP4-wild type (WT), l'attività della luciferasi è stata aumentata (Fig. 3I).Nel frattempo, la sperimentazione dell'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) ha illustrato che la sovraespressione di MTA1 ha aumentato l'arricchimento di HIF1A nella regione del promotore AQP4 (Fig. 3J, K).Inoltre, abbiamo eseguito esperimenti identici sull'epitelio del colon normale umano NCM460 e abbiamo documentato risultati simili (Figura 3A-C supplementare).Inoltre, il trattamento con LPS ha sovraregolato i livelli di mRNA e proteine ​​di AQP4 (Fig. 4A, B; Fig. 1G supplementare).Successivamente, abbiamo silenziato HIF1A nelle cellule FHC e osservato che sh-HIF1A # 1 mostrava un effetto di silenziamento superiore, e quindi è stato scelto per la successiva sperimentazione (Fig. 4C).Inoltre, sono stati osservati livelli ridotti di livelli di trascrizione di AQP4, IL-1β e TNF-α in risposta a sh-HIF1A # 1 e sh-HIF1A # 2 (Fig. 4D).La sovraespressione di AQP4 potrebbe annullare la down-regulation dei livelli di IL-1β e TNF-α indotti dal silenziamento di HIF1A (sh-HIF1A # 1 o sh-HIF1A # 2) nelle cellule FHC indotte da LPS (Fig. 4E, F).Inoltre, dopo il trattamento con LPS, la sovraespressione di AQP4 potrebbe annullare la down-regulation dei livelli di IL-1β e TNF-α causati dal silenziamento di MTA1 (sh-MTA1 # 1 o sh-MTA1 # 2) nelle cellule FHC (Fig. 4G).Inoltre, abbiamo eseguito esperimenti identici su cellule NCM460 e documentato risultati simili (Figura 4A-G supplementare).A Il livello di espressione di AQP4 nelle cellule FHC trattate con LPS determinato con RT-qPCR.B Analisi Western blot del livello proteico di AQP4 in cellule FHC trattate con LPS.Convalida C RT-qPCR dell'efficienza di silenziamento di shHIF1A nelle cellule FHC.D Misurazione RT-qPCR dei modelli di espressione di HIF1A, AQP4, IL-1β e TNF-α in cellule FHC trattate con LPS con silenziamento di HIF1A.E Convalida RT-qPCR dell'efficienza di sovraespressione del plasmide di sovraespressione di AQP4 in cellule FHC.F I modelli di espressione di HIF1A, AQP4, IL-1β e TNF-α in cellule trattate con LPS con silenziamento di HIF1A rilevato da RT-qPCR.G I modelli di espressione di HIF1A, AQP4, IL-1β e TNF-α nelle cellule trattate con LPS dopo il silenziamento di MTA1.*p < 0,05;**p < 0,01;***p < 0,001.I dati di misurazione sono stati espressi come media ± deviazione standard.I dati tra due gruppi sono stati confrontati dal test t dello studente spaiato e i dati tra più gruppi sono stati confrontati dall'ANOVA unidirezionale, seguito dai test post hoc di Tukey.L'esperimento è stato condotto tre volte indipendentemente.I topi sperimentali presentavano una maggiore apoptosi indotta da DSS (Fig. 5A).Risultati successivi hanno dimostrato che il tasso apoptotico indotto da DSS delle cellule epiteliali del colon era ridotto e il tasso di vitalità cellulare era aumentato nei topi silenziando HIF1A o MTA1, mentre veniva annullato dalla sovraespressione di AQP4 (Fig. 5B-E).Inoltre, abbiamo eseguito esperimenti identici su cellule NCM460 e documentato risultati simili (Figura 5A-E supplementare).Una colorazione TUNEL dell'apoptosi cellulare del tessuto del colon nella colite sperimentale indotta da DSS.B Il tasso di vitalità cellulare rilevato dal test CCK-8 in cellule trattate con LPS con silenziamento MTA1.C Il tasso apoptotico rilevato dalla citometria a flusso nelle cellule trattate con LPS con silenziamento MTA1.D Il tasso di vitalità cellulare rilevato dal test CCK-8 dopo AQP4 è stato sovraespresso in cellule trattate con LPS con silenziamento MTA1.E Il tasso apoptotico rilevato dalla citometria a flusso dopo AQP4 era sovraespresso nelle cellule trattate con LPS con silenziamento MTA1.*p < 0,05;**p < 0,01;***p < 0,001.I dati di misurazione sono stati espressi come media ± deviazione standard.I dati tra due gruppi sono stati confrontati dal test t dello studente spaiato e i dati tra più gruppi sono stati confrontati dall'ANOVA unidirezionale, seguito dai test post hoc di Tukey.L'esperimento è stato condotto tre volte indipendentemente.Dopo il trattamento con DSS su topi trattati con TGN-020, TGN-020 ha alleviato la perdita di peso e l'accorciamento del colon dei topi dopo il trattamento con DSS (Fig. 6A, B).Nel frattempo, rispetto al DMSO, il trattamento con DSS ha provocato un ispessimento della parete del colon, come evidenziato da una grande concentrazione di infiltrazione di cellule immunitarie nei topi;nel frattempo, TGN-020 ha alleviato i suddetti risultati, con una parete del colon più sottile e una minore concentrazione di infiltrazione di cellule immunitarie rispetto al trattamento DSS (Fig. 6C-E).Inoltre, TGN-020 ha ridotto il grado di apoptosi delle cellule epiteliali del colon nei topi indotti da DSS (Fig. 6F).I tassi positivi di CD45 e AQP4 nel tessuto del colon dei topi trattati con TGN-020 sono stati ridotti (Fig. 6G).A L'analisi statistica per le variazioni del peso del topo dopo il trattamento con TGN-020.B La lunghezza del colon dei topi dopo il trattamento con TGN-020.Colorazione C HE per osservare i cambiamenti patologici dei tessuti del colon nei topi trattati con TGN-020 (200 ×).D Risultati del punteggio statistico.E Quantificazione grafica dello spessore della parete del colon.Analisi della colorazione F TUNEL dell'apoptosi delle cellule epiteliali del colon nei topi trattati con TGN-020.G Immunoistochimica dell'espressione di CD45 e AQP4.*p < 0,05.I dati di misurazione sono stati espressi come media ± deviazione standard.I dati tra due gruppi sono stati confrontati dal test t dello studente spaiato e i dati tra più gruppi sono stati confrontati dall'ANOVA unidirezionale, seguito dai test post hoc di Tukey.L'esperimento è stato condotto tre volte indipendentemente.n = 8;***p < 0,001.La sperimentazione iniziale ha dimostrato che MTA1 era altamente espresso nei modelli murini di colite sperimentale indotta da DSS.Nonostante la mancanza di ricerche sul ruolo dell'MTA1 nella colite sperimentale, numerosi studi hanno documentato il coinvolgimento dell'MTA1 nel cancro del colon-retto e nelle risposte infiammatorie.Ad esempio, MTA1, come bersaglio diretto di miR-421, è stato precedentemente illustrato per manipolare la progressione cellulare del cancro del colon-retto [19].Inoltre, uno studio precedente ha determinato che l'MTA1 attivato durante le risposte infiammatorie potrebbe mediare l'infiammazione in coordinamento con la transglutaminasi 2, mentre MTA1 è anche noto per stimolare l'infiammazione indotta dal cristallo di urato monosodico [20, 21].Insieme, questi risultati fanno luce sul coinvolgimento di MTA1 nella colite sperimentale.Inoltre, MTA1 ha facilitato la colite sperimentale attraverso la regolazione dell'HIF1A.Allo stesso modo, numerosi studi hanno riscontrato interazioni tra MTA1 e HIF1A in varie condizioni.Uno studio particolare ha identificato che l'up-regulation di MTA1 ha elevato HIF1A nei trofoblasti in condizioni ipossiche e potrebbe servire ulteriormente come mediatore della funzione del trofoblasto e differenziazione in una gravidanza precoce [22].Inoltre, è noto che MTA1 migliora la stabilità della proteina HIF1A mediante il reclutamento di partecipazione dell'istone deacetilasi 1 [23].Inoltre, l'accumulo di prove ha suscitato il ruolo stimolante di HIF1A nella colite sperimentale.Ad esempio, la stabilizzazione di HIF1A da parte di NIX, che era altamente espressa nell'epitelio intestinale dei pazienti con colite ulcerosa, era stata precedentemente scoperta per facilitare l'aggravamento del danno mitocondriale nell'infiammazione intestinale [24].Inoltre, un altro studio ha dimostrato che la repressione dell'asse Ras-PI3K-Akt-HIF1A mediante il trattamento con il decotto Huangqin potrebbe alleviare la colite ulcerosa indotta da DSS nei modelli murini, il che è in accordo con i nostri risultati [25].Il decotto Huangqin è composto principalmente da baicalina, liquiritina, berberina, palmatina e acido glicirretico, mentre come suo componente principale, la baicalina possiede la capacità di attenuare l'apoptosi delle cellule H9c2 esposte all'ipossia elevando HIF1α [26, 27].È inoltre noto che la baicalina riduce i livelli di AQP4, TNF-α e IL-1β nei ratti con emorragia subaracnoidea [28].Sorprendentemente, uno studio precedente ha anche documentato che la berberina potrebbe sopprimere l'HIF1α e inibire la radioresistenza del cancro alla prostata [29].Nel frattempo, aumentate espressioni di HIF1A sono state precedentemente identificate nel colon di topi con colite ulcerosa indotta da DSS, il che ribadisce il significato dei nostri risultati [30].Inoltre, un'altra scoperta fondamentale è stata che l'HIF1A ha indotto la trascrizione di AQP4, che ha esacerbato il verificarsi abituale di colite sperimentale.Grazie al duro lavoro dei nostri colleghi, il ruolo di AQP4 nella colite sperimentale è ben consolidato.Ad esempio, AQP4 è stato precedentemente identificato come un gene significativamente sovraregolato nella colite sperimentale [31].Inoltre, è stato stabilito che la carenza di AQP4 comporta il miglioramento della colite sperimentale nei modelli murini [13].Inoltre, una pletora di studi ha determinato la relazione tra HIF1A e AQP4.Espandendo lo stesso, uno studio particolare si è imbattuto nella capacità di HIF1A di regolare il metabolismo del suo marcatore a valle AQP4 nella formazione di edemi e nella bioenergetica [32].Ulteriormente in linea con i nostri risultati, è noto che la soppressione farmacologica di HIF1A dovuta al 2-metossiestradiolo induce un declino nell'espressione di AQP4 a seguito di lesione cerebrale traumatica [33].Alla luce dei suddetti risultati, MTA1 può facilitare il legame di HIF1A nella regione del promotore di AQP4, che aumenta l'espressione di AQP4 e quindi promuove l'infiammazione delle cellule epiteliali e l'apoptosi nella colite sperimentale (Fig. 7).MTA1 può attivare HIF1A per indurre il legame di HIF1A nella regione del promotore di AQP4, e quindi promuovere il pattern di espressione di AQP4, promuovendo così il verificarsi della risposta infiammatoria e dell'apoptosi delle cellule epiteliali.Inoltre, sulla base del meccanismo molecolare, TGN-020, l'inibitore selettivo di AQP4, può suscitare un ruolo alleviatore nella colite sperimentale nei topi.L'attuale studio è stato condotto con l'approvazione del comitato etico del Northern Jiangsu People's Hospital.I protocolli di sperimentazione animale erano conformi alle Linee Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio emanate dal National Institutes of Health.Cellule renali embrionali umane HEK293T e cellule epiteliali del colon normali umane cellule FHC sono state acquistate dall'ATCC (HEK293T: ACS-4500, FHC: crl-1831, www.atcc.org).Inoltre, la linea cellulare epiteliale del colon umano NCM460 è stata ottenuta da CGMCC.Le cellule HEK293T e NCM460 ottenute sono state quindi coltivate in DMEM e le cellule FHC sono state coltivate con RPMI-1640 (Gibco) a 37 ° C con il 5% di CO2 nell'aria.Le cellule sono state infettate con l'adenovirus contenente il controllo dell'RNA a forcina corta (shCtrl; controllo per shRNA), shMTA1#1, shMTA1#2, shAQP4#1, shAQP4#2, shHIF1A#1, shHIF1A#2.Il plasmide di sovraespressione AQP4 è stato ottenuto da Addgene (Cambridge, MA).Successivamente, le cellule FHC e NCM460 sono state trattate con 1 μg/mL di LPS (Sigma-Aldrich Chemical Company, St Louis, MO) per 24 ore per indurre una risposta infiammatoria in vitro [34].Prima della trasfezione, il plasmide bersaglio è stato trattato con Pac I (generalmente 6 μg per un disco cellulare da 60 mm).Successivamente, i plasmidi trattati con 6 μg di Pac I sono stati trasfettati in cellule HEK293T con PEI o altri reagenti di trasfezione.Dopo 8 ore, sono stati aggiunti 4 ml di DMEM (10% di soluzione salina tamponata con citrato, 1% di penna/streptococco).Le cellule sono state quindi raschiate dalla bottiglia e trasferite in una provetta conica da 50 mL da 7 a 10 giorni dopo la trasfezione.Dopo la centrifugazione, le cellule sono state risospese con 2,0 mL di PBS.Successivamente, le cellule sono state conservate in azoto liquido, disciolte in un bagno d'acqua a 37°C e agitate vigorosamente.I passaggi precedenti sono stati eseguiti 4 volte.Successivamente, le cellule HEK293T sono state poste in un disco di coltura da 60 mm con una confluenza cellulare del 50–70% e il surnatante contenuto nel virus è stato aggiunto con un rapporto in volume del 30–50%.Una significativa lisi cellulare o CPE era evidente 2-3 giorni dopo l'infezione.Quando da 1/3 a 1/2 delle cellule erano libere e fluttuanti, il virus è stato isolato 3-5 giorni dopo l'infezione.La presenza di adenovirus ricombinante è stata successivamente convalidata mediante analisi western blot o mediante l'aggiunta di 5 μL di supernatante virale con 10 μL di Proteasi K di grado PCR, digestione a 55 ° C per 1 ora, ebollizione per 5 minuti, centrifugazione e PCR (1 –2 ml).Il supernatante virale è stato raccolto con una concentrazione minima di 1 × 107 particelle infettive/mL di virus.Per un'ulteriore amplificazione, il surnatante del virus ottenuto è stato adottato per infettare le cellule nel disco di coltura da 100 mm e il virus è stato isolato per la successiva infezione delle cellule HEK293T in un disco di coltura da 150 mm per preparare una concentrazione appropriata del virus.Successivamente, il 15% di CsCl e il 40% di CsCl sono stati aggiunti a una provetta da centrifuga Beckman per preparare la soluzione di gradiente di CsCl.Successivamente, il supernatante virale arricchito con particelle virali è stato aggiunto alla soluzione gradiente CsCl.L'ultracentrifugazione è stata quindi eseguita a 30000 rpm a 4°C per 16 ore.Dopo la centrifugazione sono state identificate due bande.La banda che si presentava con la posizione più alta e il colore più debole era considerata i gusci di adenovirus principalmente vuoti, che non avevano la capacità di infettare;la banda richiesta con posizione più bassa e colore più brillante contenente particelle di virus vivo è stata isolata con un ago 16.La dialisi è stata successivamente eseguita in soluzione fisiologica tamponata con tris (TBS) per 1 ora, seguita da due regimi di dialisi in TBS contenente il 10% di glicerolo, per 1 ora ogni volta.L'adenovirus purificato è stato aliquotato in provette Eppendorf.Nel biofotometro di Eppendorf, 1 μg di proteina virale è risultato equivalente a 4 × 109 particelle di virus.Infine, i campioni raccolti sono stati conservati a -80°C.Quaranta topi BALB/c femmine (di età compresa tra 5 e 6 settimane) sono stati forniti da Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, Cina).Dopo 5 giorni di acclimatazione, i topi sono stati alimentati con (1) acqua normale, (2) soluzione di DSS al 2%, (3) dimetilsolfossido (DMSO), (4) DMSO + 2% DSS (alimentati con DMSO contenente il 2% di DSS ), e (5) TGN-020 + 2% DSS (alimentato con 2% DSS e iniettato per via intraperitoneale con TGN-020 a 250 mg/kg) una volta al giorno per un periodo di 7 giorni, a seguito dei quali le alternanze nel peso dei topi sono stati continuamente osservati e registrati.Dopo 30 giorni, i topi sono stati soppressi e i tessuti del colon sono stati raccolti per le analisi successive.L'investigatore è stato accecato all'allocazione del gruppo durante l'esperimento e/o durante la valutazione dei risultati.Innanzitutto, campioni di tessuto del colon con infiammazione grave di 2 cm sono stati fissati con una soluzione di formaldeide al 10% per 24 ore, inclusi in paraffina e sezionati (5 μm).Dopo la deparaffinazione con xilene, le sezioni sono state disidratate con alcol a gradiente, quindi immerse in una soluzione di ematossilina per 5 minuti, in alcol di acido cloridrico all'1% per 30 s e in una soluzione di eosina allo 0,5% per 5 minuti e infine disidratate con alcol a gradiente.Successivamente, le sezioni sono state ripulite, sigillate e osservate al microscopio (DM4B; Leica Biosystems, Shanghai, Cina).Due centimetri di campioni di tessuto del colon infiammatorio grave sono stati fissati in una soluzione di formalina al 10%, inclusi in paraffina e sezionati (5 μm).L'immunoistochimica è stata eseguita come precedentemente descritto [35].Dopo passaggi convenzionali, le fette sono state quindi sottoposte ad incubazione notturna a 4 °C con coniglio antiumano contro AQP4 (1:1000, ab90088, Abcam, Cambridge, UK) e CD45 (1:200, #13917, Cell Signaling Technologies [ CST], Beverly, MA).Il giorno seguente, le fette sono state incubate con un anticorpo secondario di capra anti-coniglio contro l'immunoglobulina G (IgG) (ab6785, 1:1000, Abcam) per 20 minuti a 37 °C.La soluzione di lavoro di Streptomyces ovalbumin etichettata con perossidasi di rafano (HRP) (0343-10000U, Imunbio, Pechino, Cina) è stata quindi aggiunta alle fette, seguita da reazione a 37 ° C per 20 minuti.Dopo lo sviluppo del colore diaminobenzidina (DAB) (ST033, Whiga, Guangzhou, Cina), è stata impiegata ematossilina (PT001, Shanghai Boogu Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Cina) per contrastare le fette.Il contenuto totale di RNA è stato estratto con le istruzioni del kit TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA), seguito dalla determinazione della concentrazione di RNA.La trascrizione inversa è stata eseguita utilizzando kit di trascrizione inversa di cDNA (K1622, Yaanda Biotechnology Co., Ltd., Pechino, Cina).La PCR quantitativa fluorescente è stata eseguita con uno strumento PCR quantitativo a fluorescenza (ViiA 7, Daangene, Guangzhou, Cina).I primer sono stati sintetizzati da Sangon Biotechnology (Shanghai, Cina) (Tabella Supplementare 2).GAPDH era considerato un normalizzatore e i livelli di trascrizione relativi del gene bersaglio sono stati calcolati utilizzando il metodo 2-△ △ Ct.La digestione della tripsina è stata effettuata per isolare le cellule in coltura o tagliare i tessuti, dopo di che è stata aggiunta una lisi potenziata del test di radioimmunoprecipitazione contenente un inibitore della proteasi (Boster, Wuhan, Cina) per la lisi ad ultrasuoni.Successivamente, sono stati adottati kit quantitativi di proteine ​​​​dell'acido bicinconinico (Boster) per determinare la concentrazione proteica.Successivamente, le proteine ​​​​sono state separate mediante elettroforesi su gel di dodecil solfato di sodio (SDS)-poliacrilammide al 10% e trasferite su una membrana di fluoruro di polivinilidene.Dopo il blocco, gli anticorpi primari diluiti contro AQP4 (1:1000, #59678, CST), HIF1A (1:1000, #36169, CST), MTA1 (1:500, ab71153, Abcam) e GAPDH (1:1000, # 5174, CST) sono stati successivamente utilizzati per sondare la membrana a 4°C durante la notte.Il giorno seguente, la membrana è stata nuovamente sondata con l'anticorpo secondario marcato con HRP (proteintech anti-coniglio di capra; SA00001-1; proteintech anti-topo di capra; SA00001-2) per 1 ora.La soluzione di lavoro a chemiluminescenza potenziata (Millipore Corp., Billerica, MA) è stata aggiunta per la coltura per 1 minuto.Successivamente, la membrana è stata collocata nell'imager automatico Bio-rad per l'esposizione.Il software Image Lab è stato applicato per quantificare i livelli di grigio.Dopo la digestione dell'endonucleasi di restrizione, il frammento AQP4 contenente siti di legame HIF1A WT o MUT è stato inserito nel plasmide reporter del vettore pGL3 con l'aiuto della DNA ligasi T4 per ottenere pGL3-AQP4-WT o pGL3-AQP4-MUT.Il vettore di sovraespressione HIF1A o il vettore di controllo sono stati, rispettivamente, co-trasfettati nelle cellule per 36 ore.Successivamente, il mezzo di crescita è stato completamente aspirato, seguito dall'aggiunta di 1 × tampone di lisi passivo per la lisi completa.Per il rilevamento sono stati adottati un sistema reporter a doppia luciferasi (E910, Promega Corporation, Madison, WI) e un rivelatore luminescente del substrato della luciferasi.Tutti i passaggi sono stati eseguiti in stretta conformità con il manuale del prodotto e le procedure consigliate nel manuale operativo.Le cellule sono state fissate con formaldeide all'1% a 37 ° C per 10 minuti, quindi risciacquate due volte con fosfato freddo contenente diversi inibitori della proteasi (1 mM di fenilmetilsulfonilfluoruro, 1 μg/mL di aprotinina e 1 μg/mL di pepsina A).Successivamente, le cellule sono state incubate in tampone di lisi a pH 8,1 comprendente SDS all'1%, acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) 10 mM e Tris-HCl 50 mM per 10 minuti, dopodiché il DNA genomico è stato affettato mediante ultrasuoni.Dopo 10 minuti di centrifugazione del lisato a 13.000 giri/min e 4 °C, il supernatante è stato diluito con una varietà di reagenti, tra cui 0,01% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl, 167 mM NaCl (pH 8,1) e inibitore della proteasi.L'anticorpo anti-HIF1A (AF1935, R&D Systems, Minneapolis, MN) è stato quindi integrato con il lisato e messo in coltura durante la notte a 4 ° C.Il giorno successivo, sono stati recuperati frammenti di DNA ed è stata eseguita l'amplificazione PCR con i primer specifici per rilevare il grado di arricchimento del frammento del promotore AQP4 che si lega a HIF1A.In stretta conformità con le istruzioni del produttore, è stato utilizzato il sistema colorimetrico DeadEnd TUNEL (Promega) per valutare il grado di apoptosi delle cellule epiteliali della mucosa del colon.In breve, la soluzione cromogenica DAB è stata aggiunta ai campioni per 3-6 minuti per facilitare lo sviluppo del colore.Dopo la colorazione di contrasto con ematossilina, l'apoptosi cellulare è stata osservata al microscopio ottico.Le cellule FHC sono state seminate in piastre da 96 pozzetti, a 1 × 103 cellule/pozzetto.