Parassiti e vettori volume 15, Numero articolo: 274 (2022 ) Cita questo articoloL'infezione da Neospora caninum, un importante parassita protozoico intracellulare obbligato, causa disfunzioni riproduttive (es. aborti) nei ruminanti (es. bovini, ovini e caprini), portando a gravi perdite economiche del bestiame in tutto il mondo, ma i meccanismi patogeni di N. caninum sono poco conosciuti .È stato riportato che la disfunzione mitocondriale è strettamente associata alla patogenesi di molte malattie infettive.Tuttavia, l'effetto dell'infezione da N. caninum sulla funzione mitocondriale degli ospiti rimane poco chiaro.Gli effetti dell'infezione da N. caninum sulla disfunzione mitocondriale nelle cellule epiteliali endometriali caprine (EEC), comprese le specie reattive dell'ossigeno intracellulare (ROS), il potenziale della membrana mitocondriale (MMP), il contenuto di adenosina trifosfato (ATP), i numeri di copie del DNA mitocondriale (mtDNA) e ultrastruttura dei mitocondri, sono stati studiati utilizzando JC-1, DCFH-DA, kit di test ATP, reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR) e microscopia elettronica a trasmissione, rispettivamente, e i ruoli regolatori di sirtuin 1 (SIRT1) su la disfunzione mitocondriale, l'autofagia e la propagazione di N. caninum nelle EEC caprine sono state studiate utilizzando due farmaci, vale a dire il resveratrolo (un attivatore di SIRT1) ed Ex 527 (un inibitore di SIRT1).L'attuale studio ha scoperto che l'infezione da N. caninum ha indotto una disfunzione mitocondriale delle EEC caprine, compreso l'accumulo di ROS intracellulari, riduzioni significative di MMP, contenuto di ATP, numeri di copie del mtDNA e ultrastruttura danneggiata dei mitocondri.L'espressione downregolata di SIRT1 è stata rilevata anche nelle EEC caprine infettate da N. caninum.I trattamenti con resveratrolo ed Ex 527 per le EEC caprine hanno mostrato che la disregolazione di SIRT1 ha invertito significativamente la disfunzione mitocondriale delle cellule causata dall'infezione da N. caninum.Inoltre, utilizzando resveratrolo ed Ex 527, l'espressione di SIRT1 è risultata associata negativamente all'autofagia indotta dall'infezione da N. caninum nelle EEC caprine e la propagazione intracellulare dei tachizoiti di N. caninum nelle EEC caprine è stata influenzata negativamente dall'espressione di SIRT1.Questi risultati hanno indicato che l'infezione da N. caninum ha indotto una disfunzione mitocondriale sottoregolando SIRT1 e la sottoregolazione di SIRT1 ha promosso l'autofagia cellulare e la proliferazione intracellulare dei tachizoiti di N. caninum nelle EEC caprine.I risultati hanno suggerito un potenziale ruolo di SIRT1 come obiettivo per lo sviluppo di strategie di controllo contro l'infezione da N. caninum.I mitocondri, un organello funzionalmente versatile, sono apprezzati come la centrale elettrica delle cellule per mantenere la produzione di energia e la stabilità convertendo l'ossigeno e i metaboliti gluconici in adenosina trifosfato (ATP) e per regolare i segnali redox [1, 2].Prove recenti hanno anche indicato il ruolo fondamentale dei mitocondri nel modulare precise risposte immunitarie contro insulti infettivi e sterili [3,4,5,6].La disfunzione mitocondriale si verifica quando le cellule sono sottoposte a una varietà di stimoli avversi da fonti esterne (ad es. infezioni da Staphylococcus aureus, herpesvirus bovino-1 e Trypanosoma cruzi) e interne (ad es. peptide-β amiloide e ossido nitrico/perossinitrito), portando a morfologia mitocondriale, riduzione delle attività dei complessi di fosforilazione ossidativa mitocondriale e dell'ATP sintasi, diminuzione del potenziale di membrana mitocondriale (MMP) e accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS) [7,8,9,10,11].Le suddette anomalie potrebbero eventualmente causare stress ossidativo, diminuzione dell'apporto energetico, disordini metabolici, danni al DNA, disregolazione del calcio, apoptosi cellulare e infiammazione [12,13,14].Dati crescenti hanno mostrato che la disfunzione mitocondriale è stata implicata nel contributo alla patogenesi della neurodegenerazione (es. morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson), metabolica (es. malattia renale diabetica), cardiovascolare (es. malattia coronarica, aterogenesi) e infettiva (es. mastite, epatite C, Malattia di Chagas) malattie [15,16,17,18,19,20].La neosporosi, causata dal parassita protozoo obbligato intracellulare Neospora caninum, è una delle principali cause di aborto o natimortalità nelle bovine gravide [21].È stato riportato che l'infezione da Neospora caninum è responsabile di circa il 12-42% dei feti abortiti nelle vacche da latte e ha causato l'aborto nei bovini con perdite medie stimate in > 1,298 miliardi di dollari USA all'anno, con il massimo a 2,380 miliardi di dollari USA [ 22, 23].Tuttavia, a causa della scarsa comprensione dei meccanismi patogeni di N. caninum, non sono attualmente disponibili farmaci e vaccini efficaci contro questa malattia.È stato riportato che l'infezione da Neospora caninum induce l'accumulo di ROS e la riduzione dei livelli di ATP, con conseguente danno ossidativo nelle mucche e nei gerbilli [24, 25].L'analisi del trascrittoma delle cellule endoteliali cerebrovascolari ha rilevato che l'infezione da N. caninum ha indotto una maggiore espressione di 21 geni mitocondriali che hanno contribuito alle funzioni del complesso I, II, III, IV e V [26].L'analisi RNA-seq delle cellule del trofoblasto bovino ha mostrato che l'infezione da N. caninum alterava l'espressione di diverse ossidoreduttasi (es. SOD2) [27].Tuttavia, pochi studi sono stati condotti per svelare il mistero della disfunzione mitocondriale durante l'infezione da N. caninum.Sirtuin 1 (SIRT1), un'istone deacetilasi NAD+-dipendente, è stato segnalato per essere un importante regolatore del controllo metabolico e della biogenesi mitocondriale in un'ampia gamma di processi fisiologici e malattie (ad esempio diabete mellito, invecchiamento e malattie infiammatorie) e anche identificato come un bersaglio terapeutico probabilmente promettente per il trattamento di malattie autoimmuni e fallimenti riproduttivi [28,29,30,31,32].È stato riscontrato che una ridotta espressione di SIRT1 è associata alla disfunzione mitocondriale aumentando il danno di ROS e DNA nei gameti maschili e femminili [33].Il ruolo protettivo di SIRT1 è stato osservato anche in diverse malattie infettive, comprese infezioni di virus (es. virus respiratorio sinciziale e virus dengue), batteri (es. Pseudomonas aeruginosa e Helicobacter pylori) e parassiti protozoi (es. Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi e Cryptosporidium parvum) [34,35,36,37,38,39,40].Nel presente studio, la disfunzione mitocondriale ei suoi meccanismi associati a SIRT1 durante l'infezione da N. caninum sono stati studiati utilizzando cellule epiteliali endometriali caprine (EEC).Il ceppo selvatico di Neospora caninum Nc-1 è stato un dono del Prof. Qun Liu della China Agricultural University, Pechino, Cina.Le cellule epiteliali renali di scimmia verde africana (cellule Vero) utilizzate per il passaggio dei tachizoiti di N. caninum sono state gentilmente fornite dal Prof. Xuefeng Qi della Northwest A&F University, Shaanxi, Cina.Secondo il nostro studio precedente, è stato stabilito un modello in vitro di infezione da N. caninum nelle EEC caprine (dono del Prof. Yaping Jin della Northwest A&F University, Shaanxi, Cina), con molteplicità di infezione (MOI) di 3:1 (parassita :cella) [41].La MMP dei mitocondri intracellulari è stata monitorata utilizzando il kit di analisi del potenziale della membrana mitocondriale con JC-1 (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina) secondo le istruzioni del produttore.In breve, le EEC caprine sono state seminate in piastre di coltura cellulare da 12 pozzetti (Shanghai Sangon Biotech, Shanghai, Cina) e infettate con tachizoiti di N. caninum con un MOI di 3:1 (parassita: cellula) per 48 ore.Quindi, le cellule sono state lavate con PBS e incubate con JC-1 (1 ×) al buio per 30 minuti a 37 ℃.Dopo il lavaggio con il tampone di lavaggio JC-1 (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina), le cellule sono state osservate al microscopio a fluorescenza invertita (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania) per rilevare la fluorescenza del verde (lunghezze d'onda di eccitazione/emissione = 490/530 nm) e rosso (lunghezze d'onda di eccitazione/emissione = 525/590 nm).La relativa MMP è stata espressa come il rapporto delle intensità di fluorescenza rosso/verde.La produzione intracellulare di ROS è stata misurata utilizzando 2',7'-dicloro-fluorescina diacetato (DCFH-DA) (Abmole, Shanghai, Cina).Le EEC Caprine sono state seminate in piastre di coltura cellulare da 12 pozzetti (Shanghai Sangon Biotech, Shanghai, Cina) e infettate con tachizoiti di N. caninum con un MOI di 3:1 (parassita: cellula) per 48 ore.Le cellule sono state lavate con PBS e incubate con DCFH-DA (10 μM) al buio per 20 minuti a 37 ℃.Dopo aver lavato le cellule con un mezzo DMEM/F12 privo di siero per 5 minuti, l'intensità della fluorescenza è stata rilevata sotto una microscopia a fluorescenza invertita (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania).L'intensità della fluorescenza del verde (lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 488/530 nm) rappresentava i livelli di ROS intracellulari.I livelli intracellulari di ATP sono stati misurati utilizzando un kit di analisi dell'ATP (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina) secondo le istruzioni del produttore.In breve, le EEC caprine sono state seminate in piastre di coltura cellulare a sei pozzetti (Shanghai Sangon Biotech, Shanghai, Cina) e infettate con tachizoiti di N. caninum con un MOI di 3:1 (parassita: cellula) per 48 ore.Le cellule sono state lisate utilizzando una soluzione di lisi del test ATP, quindi la soluzione di lisi cellulare è stata incubata con una soluzione di lavoro del test ATP a temperatura ambiente per 2 minuti.Il contenuto di ATP è stato misurato nelle cellule utilizzando un lettore di micropiastre fluorimetrico multifunzionale (Tecan Austria GmbH, Austria).La curva standard delle concentrazioni di ATP è stata preparata da quantità note (0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 μmol) di livelli di ATP.I risultati sono stati espressi come unità arbitrarie di luminescenza confrontate.I numeri di copie del DNA mitocondriale (mtDNA) sono stati misurati utilizzando RT-qPCR con i modelli di campioni di DNA genomico (gDNA) estratti utilizzando un kit di estrazione di DNA di sangue/cellule/tessuto (Tiangen, Pechino, Cina) secondo le istruzioni del produttore.Per determinare il livello di mRNA per il gene sirt1 durante l'infezione da N. caninum, le EEC caprine sono state seminate in piastre di coltura cellulare da 12 pozzetti (Shanghai Sangon Biotech, Shanghai, Cina) e infettate con tachizoiti di N. caninum con un MOI di 3:1 ( parassita:cellula) per 48 h.Le cellule sono state raccolte per l'estrazione dell'RNA con il reagente Trizol (Accurate Biotechnology co., Ltd., Hunan, Cina).I campioni di RNA sono stati trascritti inversamente in cDNA utilizzando un kit Evo M-MLV RT con gDNA Clean per RT-qPCR (Accurate Biotechnology Co., Ltd., Hunan, Cina).Le reazioni RT-qPCR sono state eseguite utilizzando 2 × Universal SYBR Green Fast RT-qPCR Mix (ABclonal, Wuhan, Cina) con primer specifici elencati nel file aggiuntivo 1: Tabella S1.Il gene 18 s rRNA è stato utilizzato per normalizzare il livello di espressione del mtDNA (nd1) e il gene della gliceraldeide fosfato deidrogenasi (gapdh) è stato utilizzato per normalizzare il livello di espressione del gene sirt1.L'espressione relativa dei geni bersaglio è stata calcolata utilizzando il metodo 2-ΔΔCt [42].Le EEC Caprine sono state seminate in piastre di coltura cellulare a sei pozzetti (Shanghai Sangon Biotech, Shanghai, Cina) e infettate con tachizoiti di N. caninum con un MOI di 3:1 (parassita: cellula) per 48 ore.Le cellule (circa 107 cellule per campione) sono state lavate con PBS, digerite con tripsina e raccolte mediante centrifuga a 1000 rpm per 5 minuti.I pellet cellulari sono stati incubati con glutaraldeide al 2,5% durante la notte a 4 ℃ e fissati con tetrossido di osmio all'1% per 2-3 ore.Le cellule fisse sono state disidratate con concentrazioni crescenti di etanolo, infiltrate con resina e incorporate.Le sezioni ultrasottili sono state ottenute utilizzando un ultramicrotomo (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania), doppiato con acetato di uranile al 4% e citrato di piombo e analizzate utilizzando una microscopia elettronica a trasmissione (Hitachi Ltd., Tokyo, Giappone).Le EEC Caprine sono state seminate in piastre di coltura cellulare a sei pozzetti (Shanghai Sangon Biotech, Shanghai, Cina) e infettate con tachizoiti di N. caninum con un MOI di 3:1 (parassita: cellula) per 48 ore.Le cellule sono state raccolte per l'estrazione delle proteine ​​utilizzando un tampone di lisi RIPA (Beijing Applygen Technologies Co., Ltd., Pechino, Cina) con PMSF 1 mM e inibitori proteici (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Pechino, Cina) .Le concentrazioni proteiche sono state misurate utilizzando un kit di analisi BCA (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Cina).Un totale di 25 μg di proteine ​​è stato separato mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide del 10% (per SIRT1) o del 12% (per il sequestosoma 1, SQSTM1/p62) o del 15% (per la catena leggera della proteina associata ai microtubuli, LC-3II) e trasferito a Membrane in PVDF (Millipore, Billerica, MA, USA).Le membrane sono state bloccate con latte in polvere scremato al 5% (Shanghai Sangon Biotech, Shanghai, Cina) per 2 ore e incubate per una notte con anticorpi contro SIRT1 (1:2000, Abways, Shanghai, Cina), p62 (1:5000, Abways, Shanghai , Cina), LC-3II (1:5000, Abways, Shanghai, Cina) e β-actina (1:5000, ABclonal, Wuhan, Cina) a 4 °C.L'anticorpo anti-coniglio coniugato con perossidasi di rafano (HRP) (1:5000, Abclonal, Wuhan, Cina) è stato utilizzato come anticorpo secondario per tutte le reazioni e incubato con anticorpi sopra a temperatura ambiente per 1 ora.Le immagini sono state visualizzate utilizzando un sistema di chemiluminescenza (ECL) avanzato (Beijing Applygen Technologies Co., Ltd., Pechino, Cina) e l'analisi densitometrica delle bande proteiche di interesse è stata calcolata utilizzando il software ImageJ (https://imagej.net/Fiji /Download).Per studiare l'effetto di SIRT1 sulla propagazione di N. caninum, le EEC caprine sono state incubate con un attivatore di resveratrolo (RSV) (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Pechino, Cina) o un inibitore Ex 527 (Beyotime Biotechnology, Shanghai , Cina) di SIRT1 per 1 ora e quindi infettato con N. caninum tachyzoites a un MOI di 3:1 (parassita: cellula) per 48 ore.Il numero di tachizoiti di N. caninum per vacuolo parassitoforo è stato calcolato utilizzando la microscopia ottica invertita (Olympus Co., Tokyo, Giappone) e sono stati contati un totale di 100 vacuoli.Inoltre, le citotossicità di RSV ed Ex 527 sono state analizzate utilizzando un kit per il conteggio delle cellule (CCK-8; Zeta life, California, USA) e sia 50 μM RSV che 20 μM Ex 527 non presentavano citotossicità significative per EEC caprini (file aggiuntivo 2: Fig. S1).I dati sono stati riportati come media ± deviazione standard (SD) in almeno tre esperimenti indipendenti e le differenze tra i dati sperimentali indipendenti sono state analizzate utilizzando GraphPad PRISM 6.07 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).I valori di P sono stati calcolati utilizzando il test t a due code, con un test parametrico.Il valore P < 0,05 (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001) rispetto a un gruppo di controllo appropriato è stato considerato statisticamente significativo.Per valutare la funzione mitocondriale durante l'infezione da N. caninum, i livelli di ROS, MMP, livelli di ATP e il numero di copie del mtDNA sono stati determinati in EEC caprini infettati da N. caninum per 48 ore (Fig. 1).Rispetto al gruppo di controllo senza infezione, l'infezione da N. caninum ha indotto un aumento significativo della produzione di ROS nelle EEC caprine (Fig. 1a, b).I rapporti delle intensità di fluorescenza rosso/verde erano significativamente ridotti nelle EEC caprine infette, indicando una riduzione della relativa MMP indotta dall'infezione da N. caninum (Fig. 1c, d).Sono state rilevate riduzioni significative anche per i livelli di ATP (Fig. 1e) e i numeri di copie del mtDNA (Fig. 1f) nelle EEC caprine infette.Inoltre, utilizzando TEM sono stati osservati cambiamenti ultrastrutturali mitocondriali, ad esempio fratture della cresta, deformazione mitocondriale, gonfiore e vacuolizzazione e autofagia mitocondriale (Fig. 1g).Questi risultati hanno mostrato l'insorgenza di disfunzione mitocondriale nelle EEC caprine indotte dall'infezione da N. caninum.Disfunzione mitocondriale nelle cellule epiteliali dell'endometrio caprino (EEC) indotte dall'infezione da Neospora caninum.a, b Livelli di ROS studiati da una sonda fluorescente DCFH-DA in EEC caprini infettati da tachizoiti di N. caninum a una molteplicità di infezione (MOI) di 3:1 (parassita: cellula) per 48 h.Barra della scala, 50 µm.c, d Il potenziale di membrana mitocondriale (MMP) rilevato da JC-1 nelle EEC caprine a 48 h dopo l'infezione.Barra della scala, 50 µm.e Contenuto di ATP rilevato da un kit di determinazione dell'ATP nelle EEC caprine a 48 h.f Numeri di copie del DNA mitocondriale (mtDNA) rilevati da qPCR nelle EEC caprine a 48 h.g Morfologia dell'ultrastruttura mitocondriale nelle EEC caprine rilevata a 48 ore mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM).Barra della scala, 1 µm.I dati sono mostrati come media ± deviazione standard (SD) di tre esperimenti indipendenti.I valori P sono stati calcolati utilizzando il test t di Student.**P < 0,01;***P < 0,001SIRT1 è stato segnalato come un importante regolatore della biogenesi e del turnover mitocondriale [43].L'espressione di SIRT1 è stata studiata in EEC caprini infettati da N. caninum per 48 h.È stato riscontrato che i livelli di SIRT1 sia di mRNA (Fig. 2a) che proteico (Fig. 2b, c) sono significativamente ridotti nelle EEC caprine infette.Analisi dell'espressione di Sirtuin 1 (SIRT1) in cellule epiteliali endometriali caprine (EEC) infettate con Neospora caninum.a I livelli di mRNA di SIRT1 determinati mediante RT-qPCR.I livelli proteici di SIRT1 determinati mediante western blotting.RT-qPCR (a) e western blotting (b-e) sono stati eseguiti per rilevare l'espressione di SIRT1 in EEC caprini infettati da tachizoiti di N. caninum a una molteplicità di infezioni (MOI) di 3:1 (parassita: cellula) per 48 h.Inoltre, i livelli proteici sono stati determinati in EEC caprini pretrattati con 50 μM di resveratrolo (RSV) (b, c) o 20 μM Ex 527 (d, e) per 1 ora e quindi infettati con tachizoiti di N. caninum a MOI di 3 :1 (parassita:cellula) per 48 h.I dati sono mostrati come media ± deviazione standard (SD) di tre esperimenti indipendenti.I valori P sono stati calcolati utilizzando il test t di Student.*P < 0,05;**P < 0,01;***P < 0,001Per determinare il ruolo di SIRT1 sulla disfunzione mitocondriale indotta dall'infezione da N. caninum, due farmaci, vale a dire RSV (un attivatore SIRT1) ed Ex 527 (un inibitore SIRT1), sono stati usati per trattare le EEC caprine per 1 ora prima dell'infezione.Dopo l'infezione con N. caninum per 48 ore, 50 μM di RSV hanno aumentato significativamente i livelli proteici di SIRT1 indotti dall'infezione da N. caninum (Fig. 2b, c), mentre i risultati opposti sono stati trovati utilizzando 20 μM Ex 527 (Fig. 2d , e).È interessante notare che il trattamento con 50 μM di RSV ha invertito significativamente l'effetto dell'infezione da N. caninum sui livelli di ROS (Fig. 3a, b), MMP (Fig. 3c, d), livelli di ATP (Fig. 3e) e numeri di copie del mtDNA (Fig. 3f) nelle EEC caprine, mentre l'applicazione di 20 μM Ex 527 ha notevolmente aggravato l'impatto dell'infezione da N. caninum sui livelli di MMP (Fig. 3c, d) e ATP (Fig. 3e) nelle EEC caprine.Questi risultati hanno indicato che l'infezione da N. caninum ha indotto una disfunzione mitocondriale sottoregolando SIRT1 nelle EEC caprine.Effetto di Sirtuin 1 (SIRT1) sulla disfunzione mitocondriale indotta da Neospora caninum nelle cellule epiteliali endometriali caprine (EEC).a, b Livelli di ROS rilevati da una sonda fluorescente DCFH-DA.Barra della scala, 50 µm.c, d Il potenziale di membrana mitocondriale (MMP) rilevato da JC-1.Barra della scala, 50 µm.e Contenuto di ATP rilevato da un kit di determinazione dell'ATP.f Numeri di copie del DNA mitocondriale (mtDNA) rilevati da qPCR.I livelli di ROS, il potenziale di membrana mitocondriale, i livelli di ATP e il numero di copie del mtDNA sono stati studiati in EEC caprini pretrattati con 50 μM di resveratrolo (RSV) o 20 μM di Ex 527 per 1 ora e quindi infettati con N. caninum tachizoiti a una molteplicità di infezioni (MOI) di 3:1 (parassita:cellula) per 48 h.I dati sono mostrati come media ± deviazione standard (SD) di tre esperimenti indipendenti.I valori P sono stati calcolati utilizzando il test t di Student.*P < 0,05;**P < 0,01;***P < 0,001.NS non è stata osservata alcuna differenza significativaL'autofagia nelle EEC caprine indotte dall'infezione da N. caninum è stata precedentemente trovata dal nostro gruppo [41] e studi precedenti hanno mostrato che SIRT1 era correlato all'autofagia cellulare durante infiammazioni e infezioni patogene [36, 44].Per testare l'effetto di SIRT1 sull'autofagia indotta dall'infezione da N. caninum, le EEC caprine sono state trattate con 50 μM di RSV o 20 μM di Ex 527 per 1 ora e quindi infettate con N. caninum tachizoiti per 48 ore;sono stati determinati i livelli proteici di LC-3II (un marker dell'autofagia) e p62 (una molecola per monitorare i cambiamenti del flusso dell'autofagia).Il trattamento con RSV ha invertito significativamente l'aumentata espressione di LC-3II e la riduzione di p62 causata dall'infezione da N. caninum (Fig. 4a, b), mentre il trattamento con Ex 527 ha aumentato significativamente l'espressione di LC-3II causata dall'infezione da N. caninum sebbene non avesse effetto significativo sulla riduzione di p62 che induce N. caninum (Fig. 4c, d).Questi risultati hanno suggerito che l'infezione da N. caninum inducesse l'autofagia sottoregolando SIRT1.Effetto di Sirtuin 1 (SIRT1) sull'autofagia indotta da Neospora caninum nelle cellule epiteliali endometriali caprine (EEC).a–d I livelli proteici di LC-3II determinati mediante Western blotting.e–h I livelli proteici di p62 determinati mediante western blotting.Le EEC caprine sono state pretrattate con 50 μM di resveratrolo (RSV) (a, b, e, f) o 20 μM Ex 527 (c, d, g, h) per 1 ora e quindi infettate con N. caninum tachyzoites a una molteplicità di infezione (MOI) di 3:1 (parassita:cellula) per 48 h.I dati sono mostrati come media ± deviazione standard (SD) di tre esperimenti indipendenti.I valori P sono stati calcolati utilizzando il test t di Student.*P < 0,05.NS non è stata osservata alcuna differenza significativaÈ stato riportato che l'autofagia indotta dall'infezione da N. caninum promuove la propagazione intracellulare di tachizoiti nelle EEC caprine dal nostro gruppo [41] e la downregulation di SIRT1 da parte dell'autofagia cellulare avanzata dall'infezione da N. caninum (vedi sopra).Per verificare se SIRT1 avesse un effetto negativo sulla propagazione di N. caninum tachyzoites, le EEC caprine sono state trattate con 10–50 μM RSV o 5–20 μM Ex 527 per 1 ora e quindi infettate con N. caninum tachyzoites per 48 h.Il numero medio di tachizoiti per vacuolo parassitoforo è stato calcolato contando 100 vacuoli.Sia RSV che Ex 527 hanno influenzato la replicazione dei tachizoiti di N. caninum in modo dose-dipendente nelle EEC caprine.Tre dosaggi (10, 25 e 50 μM) di RSV hanno soppresso significativamente la propagazione dei tachizoiti di N. caninum nelle EEC caprine (Fig. 5a, b), mentre 10 e 20 μM di Ex 527 hanno promosso significativamente la replicazione dei tachizoiti in vitro (Fig. 5c , d).Questi risultati hanno indicato che la downregulation di SIRT1 era benefica per la propagazione di N. caninum tachyzoites nelle EEC caprine.Propagazione intracellulare di Neospora caninum tachyzoites nelle cellule epiteliali endometriali caprine (EEC).Le EEC caprine sono state pretrattate con 10, 20 e 50 μM di resveratrolo (RSV, a, b) o 5, 10 o 20 μM Ex 527 (c, d) per 1 ora e quindi infettate con N. caninum tachyzoites a una molteplicità di infezione (MOI) di 3:1 (parassita:cellula) per 48 h.Il numero di N. caninum tachyzoites di vacuoli è stato contato selezionando casualmente 100 vacuoli parassitofori.Tre esperimenti indipendenti sono stati condotti in triplicato.I dati sono mostrati come media ± deviazione standard (SD) di tre esperimenti indipendenti.I valori P sono stati calcolati utilizzando il test t di Student.*P < 0,05.NS non è stata osservata alcuna differenza significativaÈ stato riscontrato che la disfunzione mitocondriale è associata a molte malattie patogene, portando a esiti implicati, ad esempio il progressivo declino cognitivo e l'aborto [36, 45, 46].L'aborto viene segnalato come la principale causa di perdite economiche causate dalla neosporosi negli ospiti intermedi, in particolare nei bovini e nei caprini [47].Prove sostanziali hanno suggerito che il danno mitocondriale fosse uno dei principali fattori responsabili della disfunzione riproduttiva [48].Il metabolismo e la domanda di energia nella madre in gravidanza hanno determinato un aumento dell'attività dei mitocondri placentari e della generazione di ROS [49].Stimoli anomali o infezioni patogene esterne hanno anche causato l'accumulo di mtROS e danni irreversibili ai mitocondri e alle cellule (es. apoptosi del trofoblasto), portando infine a disturbi riproduttivi [48, 50].Ad esempio, la disfunzione mitocondriale indotta dal danno ossidativo causata da T. gondii contribuirebbe all'apoptosi del trofoblasto [51].Nel presente studio, è stato riscontrato un accumulo di ROS nelle EEC caprine infette da N. caninum tachyzoites intracellulare, coerentemente con i risultati in vivo nelle mucche e nei gerbilli [25, 52].In particolare, sono state osservate significative diminuzioni del contenuto di ATP e del numero di copie del mtDNA e una grave interruzione della morfologia dei mitocondri nelle EEC caprine che infettano N. caninum, suggerendo che la disfunzione mitocondriale delle cellule endoteliali nell'utero sarebbe associata alla patogenesi dell'infezione da N. caninum.È stato identificato che SIRT1 è fortemente implicato nella durata della salute e nella longevità controllando la biogenesi mitocondriale e i processi metabolici [53, 54].La downregulation o carenza (SIRT1−/−) di SIRT1 aumenterebbe la produzione di ROS e causerebbe un danno alla funzione mitocondriale indotto da ROS, migliorando la patogenesi delle malattie.Ad esempio, l'attivazione SIRT1 utilizzando SRT1720 (un attivatore di SIRT1) ha attenuato la disfunzione mitocondriale diminuendo l'accumulo di ROS per mantenere l'omeostasi cellulare nelle cellule epiteliali intestinali causata da H2O2 [55].Le cellule dendritiche del midollo osseo SIRT1-/- hanno mostrato ulteriori diminuzioni dei livelli di MMP, ATP e generazione di ROS durante l'infezione da virus respiratorio sinciziale, portando a processi metabolici inappropriati e potenziamento delle risposte patogene [35].Nel presente studio, il livello di espressione di SIRT1 è stato ridotto a causa dell'infezione da N. caninum nelle EEC caprine.Il trattamento con RSV ha aumentato l'espressione di SIRT1 e invertito l'effetto della disfunzione mitocondriale indotta dall'infezione dei tachizoiti di N. caninum, mentre Ex 527 ha ulteriormente ridotto l'espressione di SIRT1 e ha aggravato gli effetti del danno mitocondriale causati dall'infezione da N. cannum.Questi risultati hanno indicato che la downregulation di SIRT1 ha contribuito alla disfunzione mitocondriale indotta dall'infezione di tachizoiti di N. caninum e ha suggerito un potenziale ruolo di SIRT1 nella patogenesi durante l'infezione di N. caninum.SIRT1 funziona sia come sensore metabolico che come regolatore trascrizionale con ampie funzioni cellulari (omeostasi metabolica, risposta allo stress, tumorigenesi e autofagia) [56,57,58,59].Di questi, è stato riportato che l'autofagia cellulare, un sistema di riciclo dinamico, è una delle conseguenze comuni dovute alla disfunzione mitocondriale [60].L'interazione tra autofagia cellulare e SIRT1 è stata ampiamente studiata.Ad esempio, l'attivazione di SIRT1 utilizzando SRT1720 ha inibito la sopravvivenza intracellulare e la colonizzazione di H. pylori nelle cellule gastriche attraverso l'attivazione del flusso autofagico [39].È stato scoperto che l'autofagia è indotta nelle EEC caprine infette da N. caninum sottoregolando mTOR e ha contribuito alla propagazione di N. caninum [41].Il trattamento con rapamicina (un induttore dell'autofagia) ha aumentato i carichi di parassiti e ridotto i tassi di sopravvivenza dei topi con infezione da N. caninum [61].Inoltre, l'infezione da N. caninum ha indotto la mitofagia in modo ROS-dipendente per promuovere la propagazione del parassita nei topi e ha inibito la produzione di citochine infiammatorie per ottenere l'evasione immunitaria [62].Questa evidenza ha suggerito che l'autofagia/mitofagia ha contribuito alla replicazione di N. caninum in vitro e in vivo.Nel presente studio, l'attivazione di SIRT1 mediante RSV ha inibito l'autofagia indotta dall'infezione da N. caninum, inibendo ulteriormente la propagazione di N. caninum in vitro.D'altra parte, il trattamento con Ex 527 ha ulteriormente aumentato l'espressione della proteina LC3-II a causa dell'infezione da N. caninum e ha promosso la replicazione di N. caninum nelle EEC caprine.Questi risultati hanno indicato che l'infezione da N. caninum ha sottoregolato l'espressione di SIRT1 per promuovere l'autofagia e quindi ha influenzato la propagazione di N. caninum nelle EEC caprine.Certamente, l'evidenza scientifica ha precedentemente riportato che i risultati ottenuti negli studi che utilizzano modelli in vitro non erano sempre in accordo con i risultati ottenuti nei modelli in vivo.Considerando che la fisiopatologia dell'aborto è complessa, sono necessari ulteriori studi per comprendere l'importanza del potenziale ruolo di SIRT1 come potenziale obiettivo di focalizzazione relativo al trattamento dell'infezione da N. caninum.Inoltre, il lavoro precedente ha menzionato una differenza di suscettibilità tra le specie di ruminanti.Pertanto, sarebbe interessante valutare la funzione mitocondriale in un modello di cellule epiteliali bovine infettate da N. caninum in uno studio futuro, in cui N. caninum provoca un effetto riproduttivo più grave nei bovini.Sono inoltre necessari ulteriori studi su un modello in vivo o ex vivo per approfondire la comprensione del danno mitocondriale sulla fisiopatologia dell'aborto.L'effetto sulla funzione mitocondriale sulle EEC caprine dovuto all'infezione di N. caninum è stato studiato per la prima volta a nostra conoscenza.L'infezione da Neospora caninum ha downregolato l'espressione di SIRT1 per indurre la disfunzione mitocondriale e la downregulation di SIRT1 ha ulteriormente promosso l'autofagia cellulare e la replicazione intracellulare dei tachizoiti di N. caninum nelle EEC caprine.I risultati del presente studio hanno suggerito un potenziale ruolo di SIRT1 come obiettivo per lo sviluppo di strategie di controllo contro l'infezione da N. caninum.I dati a supporto delle conclusioni di questo articolo sono inclusi nell'articolo.Reazione a catena della polimerasi quantitativa della trascrittasi inversaFan H, Shen Y, Ren Y, Mou Q, Lin T, Zhu L, et al.L'assunzione combinata di succo di mirtillo e probiotici migliora la disfunzione mitocondriale attivando SIRT1 nella steatosi epatica alcolica.Nutr Metab.2021;18:50.Zhang Q, Song W, Zhao B, Xie J, Sun Q, Shi X, et al.La quercetina attenua la neuropatia periferica diabetica correggendo l'anomalia mitocondriale attraverso l'attivazione della via AMPK/PGC-1α in vivo e in vitro.Neurosci anteriori.2021;15:636172.PubMed PubMed Central Articolo Google ScholarWeinberg SE, Sena LA, Chandel NS.I mitocondri nella regolazione dell'immunità innata e adattativa.Immunità.2015;42:406–17.CAS PubMed PubMed Central Articolo Google ScholarMills EL, Kelly B, O'Neill LAJ.I mitocondri sono le centrali dell'immunità.Immunolo naturale.2017;18:488–98.CAS PubMed Articolo Google ScholarBanoth B, Cassel SL.I mitocondri nella segnalazione immunitaria 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