Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.La suddetta percentuale di manoscritti è stata respinta negli ultimi 12 mesi.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via email.Torna a Diari » OncoTargets and Therapy » Volume 12Il 20(R)-ginsenoside Rg3 influenza le proprietà delle cellule staminali del cancro e la transizione epiteliale-mesenchimale nel cancro colorettale attraverso l'asse di segnalazione della LUMACAAutori Phi LTH, Wijaya YT, Sari IN, Kim KS, Yang YG, Lee MW, Kwon HYPubblicato l'11 dicembre 2019 Volume 2019:12 Pagine 10885—10895DOI https://doi.org/10.2147/OTT.S219063Revisione tramite revisione tra pari anonima singolaEditore che ha approvato la pubblicazione: Dr Jianmin XuLan Thi Hanh Phi,* Yoseph Toni Wijaya,* Ita Novita Sari, Kwang Seock Kim, Ying-Gui Yang, Min-Woo Lee, Hyog Young Kwon Soonchunhyang Institute of Medi-Bio Science (SIMS), Soonchunhyang University, Cheonan, Repubblica di Corea *Questi autori hanno contribuito in egual modo a questo lavoro Corrispondenza: Hyog Young Kwon;Min-Woo Lee Soonchunhyang Institute of Medi-Bio Science (SIMS), Soonchunhyang University, 25 Bongjeong-ro, Cheonan, Chungcheongnam-do 31151, Repubblica di Corea Tel +82-41-413-5021;+82-41-413-5029 E-mail [e-mail protetta];[email protected] Contesto: Le cellule staminali del cancro (CSC) sono state proposte come fattori centrali della ricaduta del cancro in molti tipi di cancro.Nel presente studio, abbiamo studiato l'effetto inibitorio del 20(R)-Ginsenoside Rg3 (Rg3R), un importante componente attivo della saponina del ginseng, sulle cellule simili a CSC e sulla transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) nel cancro del colon-retto (CRC) .Metodi: Gli effetti del ginsenoside Rg3R sulle capacità di formazione di colonie, migrazione, invasione e guarigione delle ferite delle cellule CRC sono stati determinati in linee cellulari HT29 e SW620 in vitro.Inoltre, il ginsenoside Rg3R è stato somministrato per via intraperitoneale a 5 mg/kg di peso corporeo del topo per verificarne l'effetto sulla metastasi delle cellule CRC in vivo.Risultati: Il ginsenoside Rg3R ha inibito significativamente le proprietà delle CSC, ma non ha influenzato la proliferazione cellulare.Inoltre, il trattamento con ginsenoside Rg3R ha inibito significativamente la motilità delle cellule CRC in base ai test di migrazione, invasione e guarigione delle ferite.Gli effetti inibitori del ginsenoside Rg3R sul CRC sono potenzialmente mediati da una significativa down-regulation dell'espressione dei geni di stelo e dei marcatori EMT nelle cellule CRC in modo SNAIL-dipendente.Inoltre, il trattamento con ginsenoside Rg3R ha ridotto sia il numero che le dimensioni dei noduli tumorali nei tessuti del fegato, dei polmoni e dei reni in un modello murino di metastasi.Conclusione: questi risultati hanno evidenziato il potenziale utilizzo del ginsenoside Rg3R nelle applicazioni cliniche per il trattamento del cancro del colon-retto.Parole chiave: cancro colorettale, ginsenoside Rg3R, CSC, EMTNonostante i recenti miglioramenti nel trattamento del cancro, il cancro del colon-retto (CRC) rimane una delle principali cause di morbilità e mortalità correlate al cancro in tutto il mondo.1,2 È stato indicato che il CRC ha una prognosi sfavorevole quando metastatizzato ai linfonodi o agli organi distanti.3 Pertanto , la comprensione dei meccanismi che guidano le metastasi è necessaria per lo sviluppo di nuove strategie diagnostiche e terapeutiche per migliorare gli esiti dei pazienti con CRC.È interessante notare che l'accumulo di prove ha suggerito che la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) svolge un ruolo importante nello sviluppo normale del colon, così come nella motilità e nelle metastasi dei tumori.Inoltre, studi recenti hanno indicato che le cellule staminali tumorali (CSC) sono uno dei fattori principali della ricaduta del cancro a causa della loro capacità di stabilire tassi più elevati di proliferazione, auto-rinnovamento, differenziazione multi-lignaggio e resistenza alla chemio.4–7 È stato dimostrato che le CSC svolgono ruoli chiave non solo nella progressione e nella recidiva del tumore, ma anche nelle metastasi.L'attivazione di fattori di trascrizione EMT o l'induzione di EMT potrebbe conferire le caratteristiche staminali nelle cellule tumorali ed è stato riscontrato che le cellule tumorali circolanti raccolte da pazienti con metastasi tumorali esprimono sia CSC che marcatori di cellule staminali.8 Questa relazione è stata indicata anche nel colon-retto cancro in quanto le CSC del colon-retto sono state considerate cellule "seme" per l'invasione e la metastasi nel cancro del colon-retto.9 Pertanto, è necessario comprendere e indirizzare l'EMT e le CSC per migliorare i risultati dei pazienti con CRC.Il ginseng, pianta perenne a crescita lenta appartenente al genere Panax della famiglia delle Araliaceae, è uno dei fitomedicinali tradizionali più studiati e comunemente usati al mondo.10 I ginsenosidi sono i principali componenti biologicamente attivi del ginseng.11 Ginsenoside Rg3, un protopanaxadiolo -tipo ginsenoside, è un costituente naturale farmacologicamente e fisiologicamente attivo del ginseng che ha dimostrato di esercitare vari effetti biologici, tra cui l'effetto antitumorale,12 e gli effetti antinfiammatori.13,14 Ginsenoside 20(S)-Rg3 (Rg3S) e il ginsenoside 20(R)-Rg3 (Rg3R) sono epimeri dipendenti dalla posizione del gruppo ossidrile (OH) sul carbonio-20;l'epimerizzazione è prodotta dall'attacco selettivo del gruppo OH dopo aver eliminato il residuo glicosilico al carbonio-20 durante il processo di cottura a vapore.15 Uno studio precedente ha mostrato che il ginsenoside Rg3R, ma non il ginsenoside Rg3S, inibisce l'EMT indotto dal TGF β1, la migrazione del cancro del polmone, invasione e resistenza all'anoikis.16 Inoltre, è stato dimostrato che il ginsenoside Rg3R inibisce la proliferazione cellulare nel carcinoma epatocellulare indotto nei ratti17 e la metastasi delle cellule di melanoma B16-BL6.18 Tuttavia, sebbene siano stati identificati gli effetti antitumorali stereospecifici di Rg3, gli effetti del ginsenoside Rg3R sulle proprietà simili a CSC e sull'EMT e gli esatti meccanismi alla base di questi effetti nel CRC non sono completamente compresi.Qui, abbiamo valutato gli effetti antitumorali del ginsenoside Rg3R nel CRC e i corrispondenti meccanismi molecolari alla base di questi effetti.È stato scoperto che il ginsenoside Rg3R inibisce le proprietà e le metastasi delle CSC nel CRC in vitro e in vivo.I risultati attuali non solo hanno dimostrato gli effetti antitumorali del ginsenoside Rg3R, ma hanno anche rivelato che questi effetti erano mediati dalla downregulation dei marcatori di staminalità.Inoltre, questo ginsenoside ha inibito significativamente la formazione di noduli di metastasi tumorali in un modello di metastasi di topo.Pertanto, i nostri risultati hanno fornito nuove informazioni che evidenziano il potenziale utilizzo del ginsenoside Rg3R come nuovo agente antitumorale per il trattamento del CRC.Il ginsenoside Rg3R è stato ottenuto dall'Ambo Institute (Corea).È stato sciolto a una concentrazione di 20 mM in DMSO come soluzione madre e conservato in aliquote a -20 ° C.Il ginsenoside Rg3R è stato aggiunto ai terreni di coltura cellulare alle concentrazioni finali di 10, 50 e 100 µM per lo studio in vitro e diluito con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a 5 mg/kg/topi per lo studio in vivo.Le linee cellulari CRC umane HT29 e SW620 sono state acquistate dalla Korean Cell Line Bank (KCLB).Le cellule HT29 e SW620 sono state coltivate in terreno RPMI-1640 (Corning, USA) integrato con 10% di siero fetale bovino (Corning, USA), 1% di amminoacidi essenziali MEM (Corning, USA) e 1% di penicillina/streptomicina (Gibco, USA) a 37°C in atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2.Le cellule sono state anche coltivate utilizzando una piastra di attacco ultra-bassa in terreni selettivi per cellule staminali, incluso il terreno DMEM/F12 integrato con supplemento di N2 all'1%, fattore di crescita epidermico 20 ng/mL EGF (Invitrogen, USA) e fattore di crescita fibroblastico di base 20 ng/mL (bFGF; Invitrogen, USA) e 1% di penicillina/streptomicina (Gibco, USA) (Corning, USA).I plasmidi contenenti il ​​frame di lettura aperto (ORF) di SNAIL (Forward, 5'-AGTCCAGAATTCATGCCGCGCTCTTTCCTCGTCAGGA-3' e reverse, 5'- AGTCCACTCGAGTCAGCGGGGACATCCTGAGCAGCCG-3') sono stati amplificati e clonati nel vettore MSCV-IRES-GFP.Le cellule 293T sono state trasfettate con costrutti virali insieme a costrutti Gag/pol e VSVG per generare i virus utilizzando i reagenti di trasfezione in vitro iN-fectTM (iNtRON, Corea) e seguendo il protocollo del produttore.I supernatanti virali sono stati raccolti nei giorni 2 e 3 dopo la trasfezione e utilizzati per infettare le cellule bersaglio.Sono stati condotti RT-PCR e Western blotting per determinare gli effetti della sovraespressione dei geni bersaglio.L'RNA è stato isolato usando Ribospin II o Hybrid R (Gene All, Korea).Il cDNA è stato convertito utilizzando ReverTra Ace® qPCR Kit (TOYOBO, Giappone) secondo le istruzioni del produttore.TOPreal™ qPCR 2x PreMIX (Enzynomics, Corea) è stato utilizzato per la reazione qPCR per determinare i livelli di espressione genica dei geni target.Le sequenze di primer per qPCR sono mostrate nella tabella supplementare 1.I lisati cellulari sono stati raccolti e la concentrazione di proteine ​​nel supernatante è stata determinata utilizzando un kit Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA).Uguali quantità di estratti cellulari (30 μg) sono state risolte su un gel di poliacrilammide al 10% ed elettro-trasferite su una membrana di filtro nitrocellulosico di ibridazione (HATF) da 0,45 μm (Millipore, USA) utilizzando Trans-blot Turbo (Bio-Rad Laboratories, Inc., STATI UNITI D'AMERICA).Le membrane sono state immunoblottate con anticorpi policlonali di capra anti-actina, anticorpi monoclonali di coniglio anti-lumaca, anticorpi policlonali di coniglio anti-EGFR, anticorpi policlonali di coniglio anti-pEGFR, anticorpi policlonali di coniglio anti-Akt e anticorpi policlonali di coniglio anti-pAkt da Cell Signaling, USA, notte a 4°C.Le membrane sono state incubate con immunoglobuline anti-coniglio coniugate con HRP (Cell Signaling, USA) o immunoglobuline anti-capra legate con HRP (Santa Cruz Biotechnology, USA) per 1 ora a temperatura ambiente.La chemiluminescenza avanzata (Thermo, USA) è stata utilizzata per rilevare i segnali delle proteine ​​con l'Amersham Imager 600 (GE Healthcare Life Sciences, Regno Unito).Il test MTT è stato eseguito per valutare la proliferazione cellulare utilizzando il Cell Proliferation Kit I secondo le istruzioni del produttore (Roche, Germania).In breve, 5 × 103 cellule sono state seminate su una piastra da 96 pozzetti e incubate per 96 ore.Le cellule sono state incubate in 5 mg/mL di soluzione MTT per 4 ore e successivamente solubilizzate con 100 µL di soluzione di solubilizzazione (10% SDS in 0,01 M HCl) durante la notte.L'assorbanza è stata letta a 575 nm e 650 nm utilizzando un lettore di piastre.La sospensione cellulare (2 × 103 cellule/pozzetto) e il ginsenoside sono stati miscelati con lo 0,3% di agarosio in mezzo completo utilizzando piastre da 24 pozzetti rivestite con lo strato di base di agarosio all'1%.La parte superiore dello strato cellulare è stata rivestita con mezzo completo per evitare l'evaporazione.Il numero e la dimensione delle colonie sono stati determinati dopo 15 giorni di incubazione.Il sistema di inserto transwell (Corning, USA) con rivestimento e senza rivestimento di 20 μL di Matrigel (BD, USA) è stato, rispettivamente, utilizzato per esaminare l'invasione e la migrazione cellulare in vitro.In breve, 100 μL di terreno privo di siero contenente 1 × 105 cellule sono stati seminati in ciascun pozzetto dell'inserto con 600 μL di terreno contenente il 10% di FBS all'esterno dell'inserto.Le cellule sono state quindi incubate a 37°C per 18 ore e 24 ore in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2 rispettivamente per i saggi di migrazione e invasione.Dopo aver pulito i transwell utilizzando uno scambio di cotone, le cellule sono state fissate con formaldeide all'1% per 15 minuti e lavate con PBS 2 volte.Le cellule sono state quindi colorate con lo 0,1% di cristalvioletto per 15 minuti e osservate al microscopio (Leica, Germania) dopo il lavaggio con DW.Le cellule (1x105) sono state seminate in una piastra da 24 pozzetti a 24 ore prima del trattamento.Il mezzo è stato quindi rimosso quando le cellule hanno raggiunto circa il 90% di confluenza.Le piastre sono state graffiate utilizzando l'estremità di una punta di pipetta da 200 µl (punto temporale 0 ore) e le cellule sono state lavate due volte con PBS per rimuovere le cellule sciolte.Successivamente, le cellule sono state quindi trattate con o senza ginsenoside Rg3R in mezzi privi di siero per 48 ore.Le immagini delle cellule in migrazione sono state catturate ogni 24 ore.Dopo 96 ore di trattamento con Rg3R in mezzi privi di siero, i supernatanti cellulari sono stati analizzati su un gel SDS-PAGE contenente lo 0,1% di gelatina.Dopo l'elettroforesi, il gel è stato rinaturato due volte con Triton X-100 al 2,5% per 30 minuti a 37°C e quindi lavato con ddH2O.Successivamente, il gel è stato incubato nel tampone di sviluppo (Tris-HCl 50 mM pH 7,6, NaCl 50 mM, CaCl2 10 mM, Brij 35 0,05%) per 24 ore a temperatura ambiente.I gel sono stati quindi colorati mediante colorazione Coomassie Brilliant Blue Protein 1 ora e decolorati utilizzando una soluzione decolorante (metanolo:ddH2O:acido acetico = 5:4:1) a temperatura ambiente.Le cellule HT29 CRC sono state raccolte e risospese con PBS a una concentrazione finale di 1,5 × 107 cellule/mL.Le cellule (1,5 × 106) sono state iniettate per via endovenosa in topi NSG femmine di otto settimane (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, The Jackson Laboratory).I topi sono stati divisi casualmente in due gruppi (controllo e trattamento con ginsenoside Rg3R) a 48 ore dopo l'iniezione.I topi sono stati quindi iniettati per via intraperitoneale con 5 mg/kg/topi di ginsenoside Rg3R o un volume uguale di PBS tre volte alla settimana e i topi sono stati osservati quotidianamente.Dopo 28 giorni, i topi sono stati sacrificati per il conteggio e l'analisi statistica del numero e del peso dei noduli tumorali nel fegato, nei polmoni e nei reni.I tessuti sono stati tagliati in sezioni spesse 4-5 μm, incorporati in paraffina e quindi colorati con ematossilina ed eosina (H&E).Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Soonchunhyang.Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la legge sul benessere degli animali da laboratorio.Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti indipendentemente almeno tre volte.I risultati di RT-qPCR, Western blotting, zimografia di gelatina, test di migrazione e invasione sono stati analizzati utilizzando il test t di Student.Le differenze sono state considerate statisticamente significative a P <0,05 (*) o altamente significative a P <0,01 (**).Il ginsenoside Rg3R è stato isolato dal ginseng Panax e la sua struttura è stata mostrata nella Figura 1A.In primo luogo, abbiamo esaminato l'effetto del ginsenoside Rg3R sulla proliferazione delle linee cellulari CRC, come HT29 e SW620.I risultati del test MTT hanno mostrato che il ginsenoside Rg3R non ha inibito la proliferazione delle cellule CRC a diverse concentrazioni (10, 50 e 100 µM di ginsenoside Rg3R) dopo 72 ore di incubazione in coltura liquida (Figura 1B e C).Successivamente, abbiamo studiato se il ginsenoside Rg3R inibisce specificamente le proprietà delle CSC, anche se la proliferazione cellulare della popolazione di massa non è stata influenzata.Uno studio recente ha evidenziato l'uso emergente della coltura cellulare 3D, dato il suo potenziale impatto sulla scoperta precoce di farmaci e sulla terapia per il trattamento di malattie, come il cancro19 perché può imitare più da vicino gli ambienti cellulari in vivo.20 Pertanto, abbiamo condotto il soft- saggio di formazione di colonie di agar, che presenta alcuni vantaggi, tra cui semplicità, validità e potenziale per la scoperta di nuovi farmaci antitumorali,21,22 utilizzando nelle cellule staminali del cancro (CSC).23,24 Entrambe le linee cellulari HT29 e SW620 sono state trattate in uno strato di terreno agar morbido contenente varie concentrazioni di ginsenoside Rg3R.È interessante notare che sia il numero delle colonie che le dimensioni sono diminuite in modo dose-dipendente dopo 15 giorni di trattamento con ginsenoside Rg3R (HT29, 67% a 10 µM, 81% a 50 µM e 88% a 100 µM; SW620, 55% a 55 %, 64% a 50 µM e 81% a 100 µM) (Figura 1D ed E).Pertanto, i risultati di cui sopra hanno suggerito che il ginsenoside Rg3R ha inibito drasticamente le proprietà delle CSC nel CRC.Figura 1 Effetto inibitorio del ginsenoside Rg3R sulla capacità di formazione di colonie di cellule CRC.(A) Struttura chimica del ginsenoside Rg3R.(B, C) Effetto del ginsenoside Rg3R sulla proliferazione delle cellule CRC.Le cellule CRC HT29 e SW620 sono state trattate con concentrazioni variabili di ginsenoside Rg3R.La proliferazione cellulare è stata misurata dopo 72 ore di coltura utilizzando il test MTT.(D ed E) Gli effetti del ginsenoside Rg3R sulla capacità di formazione di colonie di cellule CRC sono stati esaminati mediante test di formazione di colonie di agar morbido.Le cellule CRC HT29 e SW620 sono state miscelate con terreni completi in agar allo 0,3% contenente DMSO o ginsenoside Rg3R a concentrazioni diverse.Il numero di colonie formate è stato contato dopo 15 giorni di incubazione.Viene visualizzata l'analisi statistica (*P< 0,05; **P< 0,01).I dati sono stati presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti.Figura 1 Effetto inibitorio del ginsenoside Rg3R sulla capacità di formazione di colonie di cellule CRC.(A) Struttura chimica del ginsenoside Rg3R.(B, C) Effetto del ginsenoside Rg3R sulla proliferazione delle cellule CRC.Le cellule CRC HT29 e SW620 sono state trattate con concentrazioni variabili di ginsenoside Rg3R.La proliferazione cellulare è stata misurata dopo 72 ore di coltura utilizzando il test MTT.(D ed E) Gli effetti del ginsenoside Rg3R sulla capacità di formazione di colonie di cellule CRC sono stati esaminati mediante test di formazione di colonie di agar morbido.Le cellule CRC HT29 e SW620 sono state miscelate con terreni completi in agar allo 0,3% contenente DMSO o ginsenoside Rg3R a concentrazioni diverse.Il numero di colonie formate è stato contato dopo 15 giorni di incubazione.Viene visualizzata l'analisi statistica (*P< 0,05; **P< 0,01).I dati sono stati presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti.Considerando che la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali sono cruciali per la cascata metastatica,25,26 abbiamo quindi condotto un test di migrazione utilizzando un sistema di transwell non rivestito di Matrigel per valutare gli effetti del ginsenoside Rg3R sulla motilità cellulare utilizzando le linee cellulari CRC HT29 e SW620.I risultati hanno indicato che il ginsenoside Rg3R ha attenuato significativamente la capacità migratoria delle cellule tumorali da circa il 30% al 75% rispetto alle cellule trattate con il controllo (HT29, 31% a 10 µM, 50% a 50 µM e 74% a 100 µM; SW620, 43% a 10 µM, 51% a 50 µM e 71% a 100 µM) (Figura 2A-E).Inoltre, abbiamo studiato l'effetto inibitorio del ginsenoside Rg3R sulla capacità invasiva delle cellule CRC utilizzando un sistema transwell rivestito di Matrigel.Il ginsenoside Rg3R ha soppresso significativamente la capacità di invasione delle cellule CRC da circa il 30% all'80% rispetto alle cellule trattate con controllo per entrambe le linee cellulari CRC HT29 e SW620 dopo 48 ore di trattamento a diverse concentrazioni testate (HT29, 63% a 10 µM, 74% a 50 µM e 81% a 100 µM; SW620, 27% a 10 µM, 46% a 50 µM e 67% a 100 µM) (Figura 2A-F).Il test di guarigione delle ferite è stato eseguito per verificare ulteriormente l'effetto inibitorio del ginsenoside Rg3R sulla migrazione delle cellule CRC.Come mostrato nella Figura 2G-I, le cellule trattate con ginsenoside Rg3R hanno mostrato tassi di guarigione delle ferite monostrato significativamente inferiori rispetto alle cellule nella condizione di controllo.I risultati di cui sopra hanno indicato che il trattamento con ginsenoside Rg3R ha ridotto la motilità delle cellule CRC in modo dose-dipendente.Figura 2 Effetti del ginsenoside Rg3R sulla migrazione e sulla capacità di invasione delle cellule CRC.(A–F) Le capacità di migrazione e invasione delle cellule CRC sono state valutate utilizzando il sistema di inserto transwell con membrana non rivestita (A, B, D ed E) e membrana rivestita di Matrigel (A, C, D e F) , rispettivamente.Le cellule CRC HT29 e SW620 sono state trattate con concentrazioni variabili di ginsenoside Rg3R in mezzi privi di siero per 48 ore.Quindi, le cellule sono state seminate su un inserto transwell per valutare la migrazione e l'invasione cellulare.Le cellule sull'inserto sono state colorate e contate dopo 18 o 24 ore.I dati sono presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti (*P<0,05; **P<0,01).(G-I) Le cellule HT29 e SW620 sono state seminate in una piastra da 24 pozzetti e il centro della piastra è stato graffiato dopo 24 ore.Successivamente, le cellule sono state quindi lavate e trattate con DMSO o ginsenoside Rg3R in mezzi privi di siero dopo 48 ore.Il tasso di guarigione della ferita è stato controllato ogni 24 ore (HT29, G e H; SW620, G e I).È stata mostrata un'immagine rappresentativa (G).I dati sono stati presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti (* P < 0, 05; ** P < 0, 01).Figura 2 Effetti del ginsenoside Rg3R sulla migrazione e sulla capacità di invasione delle cellule CRC.(A–F) Le capacità di migrazione e invasione delle cellule CRC sono state valutate utilizzando il sistema di inserto transwell con membrana non rivestita (A, B, D ed E) e membrana rivestita di Matrigel (A, C, D e F) , rispettivamente.Le cellule CRC HT29 e SW620 sono state trattate con concentrazioni variabili di ginsenoside Rg3R in mezzi privi di siero per 48 ore.Quindi, le cellule sono state seminate su un inserto transwell per valutare la migrazione e l'invasione cellulare.Le cellule sull'inserto sono state colorate e contate dopo 18 o 24 ore.I dati sono presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti (*P<0,05; **P<0,01).(G-I) Le cellule HT29 e SW620 sono state seminate in una piastra da 24 pozzetti e il centro della piastra è stato graffiato dopo 24 ore.Successivamente, le cellule sono state quindi lavate e trattate con DMSO o ginsenoside Rg3R in mezzi privi di siero dopo 48 ore.Il tasso di guarigione della ferita è stato controllato ogni 24 ore (HT29, G e H; SW620, G e I).È stata mostrata un'immagine rappresentativa (G).I dati sono stati presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti (* P < 0, 05; ** P < 0, 01).Successivamente abbiamo studiato i meccanismi con cui il ginsenoside Rg3R ha soppresso sia la capacità di formare colonie che la capacità migratoria delle cellule CRC (Figure 1 e 2).Abbiamo profilato le firme di espressione dei geni coinvolti nella staminalità CSC e l'EMT;questi geni sono stati precedentemente stabiliti come molecole a valle coinvolte nel mantenimento delle CSC e nella mobilità delle cellule tumorali.Per valutare le proprietà CSC e le firme EMT, abbiamo misurato i livelli di RNA e proteine ​​nelle cellule HT29 e SW620 dopo 4 giorni di trattamento con ginsenoside Rg3R (da 0 a 100 µM) mediante RT-qPCR e immunoblot.I risultati hanno mostrato che il trattamento delle cellule HT29 e SW620 con ginsenoside Rg3R alle concentrazioni indicate sottoregola notevolmente i livelli di espressione di NANOG, OCT4, SNAIL e MMP2 (Figura 3A e B).I livelli proteici di SNAIL ed E-CAD e l'attività enzimatica di MMP2 sono stati costantemente e significativamente ridotti dal trattamento con ginsenoside Rg3R (Figura 3C e Figura 1 supplementare).Pertanto, i risultati hanno suggerito che il ginsenoside Rg3R può inibire l'auto-rinnovamento CSC e le metastasi tumorali delle cellule CRC regolando l'espressione delle firme CSC ed EMT.Figura 3 Il ginsenoside Rg3R inibisce le firme di espressione CSC ed EMT.Le cellule HT29 (A) e SW620 (B) sono state trattate con ginsenoside Rg3R e i livelli di RNA di SOX2, NANOG, OCT4, SNAIL e MMP2 sono stati rilevati da RT-qPCR.I dati sono stati presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti (* P < 0, 05; ** P < 0, 01).(C e D) Le cellule HT29 e SW620 sono state trattate con ginsenoside Rg3R e i livelli di proteina SNAIL sono stati quindi determinati mediante Western blotting.Sono state mostrate immagini rappresentative (C).I valori rappresentano le densità relative delle bande di blotting normalizzate ad ACTIN (D).I dati sono stati presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti (* P < 0, 05; ** P < 0, 01).Le cellule HT29 (E-G) e SW620 (E, H, I) sono state trattate con ginsenoside Rg3R e i livelli di fosforilazione di EGFR e AKT sono stati determinati mediante Western blotting.ACTIN è stato utilizzato come controllo di caricamento.Sono state mostrate immagini rappresentative (E).I valori rappresentano le densità relative delle bande di blotting normalizzate ad ACTIN (pEGFR, F e H; pAKT, G e I).I dati sono stati presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti (* P < 0, 05; ** P < 0, 01).Figura 3 Il ginsenoside Rg3R inibisce le firme di espressione CSC ed EMT.Le cellule HT29 (A) e SW620 (B) sono state trattate con ginsenoside Rg3R e i livelli di RNA di SOX2, NANOG, OCT4, SNAIL e MMP2 sono stati rilevati da RT-qPCR.I dati sono stati presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti (* P < 0, 05; ** P < 0, 01).(C e D) Le cellule HT29 e SW620 sono state trattate con ginsenoside Rg3R e i livelli di proteina SNAIL sono stati quindi determinati mediante Western blotting.Sono state mostrate immagini rappresentative (C).I valori rappresentano le densità relative delle bande di blotting normalizzate ad ACTIN (D).I dati sono stati presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti (* P < 0, 05; ** P < 0, 01).Le cellule HT29 (E-G) e SW620 (E, H, I) sono state trattate con ginsenoside Rg3R e i livelli di fosforilazione di EGFR e AKT sono stati determinati mediante Western blotting.ACTIN è stato utilizzato come controllo di caricamento.Sono state mostrate immagini rappresentative (E).I valori rappresentano le densità relative delle bande di blotting normalizzate ad ACTIN (pEGFR, F e H; pAKT, G e I).I dati sono stati presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti (* P < 0, 05; ** P < 0, 01).Precedenti studi hanno indicato che l'EGFR è fortemente sovraregolato nei pazienti con CRC, specialmente nei pazienti in stadio T3.27-29 È interessante notare che l'EGFR interagisce fortemente con vari ginsenosidi, incluso il ginsenoside Rg3;nell'EGFR mutante, è noto che il ginsenoside Rg3 interagisce con i residui di GLN791 e Pro794.30 Inoltre, diversi ginsenosidi, come il composto 31,32 Rb, 33 Rd, 34 Rh2,35 e Rg336–38 potrebbero sopprimere il livello di espressione di EGFR e anche la sua via di segnalazione.Pertanto, abbiamo studiato se il ginsenoside Rg3R inibisce le proprietà del CRC sopprimendo la trasduzione del segnale EGFR.Pertanto, abbiamo esaminato la fosforilazione dell'EGFR e la via a valle dell'AKT per identificare le vie di segnalazione che mediano gli effetti inibitori del ginsenoside Rg3R sulle cellule CRC.Entrambe le cellule HT29 e SW620 sono state trattate con ginsenoside Rg3R ed EGF, quindi la proteina è stata estratta e analizzata mediante Western blotting per esaminare i livelli di pEGFR e pAKT.Il livello di pEGFR (pEGFR/tEGFR) è stato ridotto di circa il 45% e il 24% rispetto a quelli nelle cellule di controllo dopo il trattamento con 100 µM di ginsenoside Rg3R rispettivamente in HT29 e SW620 (Figura 3E, F e H).Un modello simile è stato osservato anche nel livello di pAKT (pAKT/tAKT) che è stato ridotto di circa il 50% e 59% rispetto a quelli nelle cellule di controllo dopo il trattamento con 100 µM di ginsenoside Rg3R rispettivamente in HT29 e SW620 (Figura 3E, G e IO).I risultati di cui sopra hanno indicato che il ginsenoside Rg3R ha soppresso le proprietà simili a CSC e l'EMT nelle cellule CRC inibendo la segnalazione EGFR/AKT.Per verificare che il ginsenoside Rg3R inibisca la capacità migratoria delle cellule CRC sottoregolando la segnalazione EGFR/AKT, abbiamo esaminato se la capacità di migrazione potesse essere ripristinata aggiungendo EGF in eccesso.Abbiamo valutato la migrazione delle cellule HT29 trattate con DMSO, 50 µM di ginsenoside Rg3R da solo o 50 µM di ginsenoside Rg3R in combinazione con EGF esogeno.Il trattamento con ginsenoside Rg3R da solo ha inibito la migrazione delle cellule tumorali, mentre il trattamento combinato con EGF e ginsenoside Rg3R ha parzialmente salvato la capacità migratoria delle cellule CRC (Figura 4A e B).Inoltre, la downregulation dei livelli di RNA dei geni EGFR e SNAIL, che sono a valle della via di segnalazione dell'EGFR, dopo il trattamento con ginsenoside Rg3R, è stata drasticamente abolita dal trattamento con EGF (Figura 4C e D).Questo esperimento di guadagno di funzione ha dimostrato che gli effetti inibitori osservati del ginsenoside Rg3R dipendono dalla segnalazione dell'EGFR.Figura 4 Il ginsenoside Rg3R sopprime la migrazione delle cellule CRC tramite la segnalazione EGFR/SNAIL.(A-D) Le cellule HT29 sono state trattate con DMSO da solo, ginsenoside Rg3R da solo o ginsenoside Rg3R insieme a EGF e sono stati determinati la migrazione cellulare e i livelli di RNA.Sono state mostrate immagini rappresentative (A).I dati sono stati presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti (B, migrazione; C, livello SNAIL; D, livello EGFR).Viene visualizzata l'analisi statistica (*P< 0,05; **P< 0,01).(E-K) Le cellule HT29 sono state trasdotte con un vettore vuoto o un vettore di sovraespressione SNAIL.Le cellule trasdotte sono state quindi trattate con ginsenoside Rg3R e sono state valutate la migrazione cellulare (G e H) e la capacità di formare colonie (I e J).I livelli di espressione di SNAIL, EGFR e FIBRONCTIN sono stati determinati mediante RT-qPCR (E, K) e immunoblot (F).Sono state mostrate immagini rappresentative (F, K).I dati sono stati presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti (* P < 0, 05; ** P < 0, 01).Figura 4 Il ginsenoside Rg3R sopprime la migrazione delle cellule CRC tramite la segnalazione EGFR/SNAIL.(A-D) Le cellule HT29 sono state trattate con DMSO da solo, ginsenoside Rg3R da solo o ginsenoside Rg3R insieme a EGF e sono stati determinati la migrazione cellulare e i livelli di RNA.Sono state mostrate immagini rappresentative (A).I dati sono stati presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti (B, migrazione; C, livello SNAIL; D, livello EGFR).Viene visualizzata l'analisi statistica (*P< 0,05; **P< 0,01).(E-K) Le cellule HT29 sono state trasdotte con un vettore vuoto o un vettore di sovraespressione SNAIL.Le cellule trasdotte sono state quindi trattate con ginsenoside Rg3R e sono state valutate la migrazione cellulare (G e H) e la capacità di formare colonie (I e J).I livelli di espressione di SNAIL, EGFR e FIBRONCTIN sono stati determinati mediante RT-qPCR (E, K) e immunoblot (F).Sono state mostrate immagini rappresentative (F, K).I dati sono stati presentati come media ± SEM di tre esperimenti indipendenti (* P < 0, 05; ** P < 0, 01).Prove crescenti indicano che SNAIL svolge un ruolo essenziale nello sviluppo embrionale e nella progressione del cancro promuovendo tratti simili alle cellule staminali del cancro, metastasi, resistenza ai farmaci e recidiva del tumore.39 I nostri risultati hanno rivelato che le cellule CRC trattate con ginsenoside Rg3R hanno mRNA e proteine ​​significativamente più bassi livelli di LUMACA rispetto a quelli del gruppo di controllo (Figura 3).Inoltre, gli effetti inibitori del ginsenoside Rg3R sull'espressione di SNAIL sono stati in parte recuperati dal trattamento con EGF.Pertanto, abbiamo ipotizzato che gli effetti inibitori del ginsenoside Rg3R siano dipendenti dalla LUMACA.Per testare la nostra ipotesi, le cellule HT29 sono state trasdotte con un vettore vuoto o con un plasmide di sovraespressione di SNAIL utilizzando un sistema retrovirale.Queste cellule sono state quindi trattate con ginsenoside Rg3R per determinarne gli effetti sulla capacità migratoria delle cellule e l'espressione dei bersagli a valle.Innanzitutto, abbiamo confermato la sovraespressione di SNAIL in queste cellule sia mediante RT-qPCR che mediante Western blotting (Figura 4E e F).La capacità migratoria delle cellule tumorali trattate con ginsenoside Rg3R è stata ridotta al 42% di quella delle cellule di controllo;La sovraespressione di SNAIL ha salvato gli effetti inibitori del ginsenoside Rg3R sulla migrazione cellulare, con cellule che sovraesprimono SNAIL che mostrano circa il 90% della migrazione cellulare rispetto a quella delle cellule di controllo (Figura 4G e H).Un modello simile è stato trovato anche nella capacità di formare colonie, con cellule di sovraespressione di SNAIL che salvano in parte l'inibizione del ginsenoside Rg3R (Figura 4I e J).Coerentemente con i risultati attesi, la sovraespressione di SNAIL ha anche salvato la downregulation indotta dal ginsenoside Rg3R delle molecole a valle, EGFR e FIBRONECTIN (Figura 4K).I risultati di cui sopra hanno indicato che il ginsenoside Rg3R influisce anche sulle proprietà CSC e sull'EMT nelle cellule CRC tramite SNAIL.I risultati di cui sopra hanno indicato che il ginsenoside Rg3R inibisce le proprietà CSC e l'EMT in vitro.Pertanto, abbiamo ulteriormente esaminato gli effetti del ginsenoside Rg3R sulla metastasi delle cellule CRC in vivo utilizzando un modello di metastasi di topo.Dopo 2 giorni di iniezione di HT29 in topi NSG immunocompromessi, i topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con ginsenoside Rg3R (5 mg/kg per topo) o PBS come controllo tre volte alla settimana.I topi sono stati sacrificati a 4 settimane dopo il trapianto per valutare i noduli di metastasi tumorali nel fegato, nei polmoni e nei reni (Figura 5A).Il numero di noduli di metastasi tumorali nei tessuti del fegato, del polmone e del rene era significativamente più basso nei topi trattati con ginsenoside Rg3R rispetto a quelli nel gruppo di controllo (fegato, 244 contro 106; polmoni, 103 contro 28; rene, 134 contro 59, p<0,05) (Figura 5B e C).Inoltre, la colorazione istopatologica H&E delle sezioni epatiche ha rivelato che il ginsenoside Rg3R ha ridotto significativamente il numero di lesioni metastatiche indotte da HT29 e ha ridotto la densità dei tessuti (Figura 5D).I risultati di cui sopra erano coerenti con l'ipotesi che il ginsenoside Rg3R sopprima le metastasi nelle cellule CRC in vivo utilizzando un modello murino di metastasi.Figura 5 Il ginsenoside Rg3R inibisce la metastasi delle cellule CRC in vivo.(A) Lo schema di un modello di metastasi del topo.Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.Mondo J Gastroenterol.Crit Rev Oncol Hematol.Bmj.Cancro colorettale Clin.Cellule staminali.Mondo J Gastroenterol.Cellule staminali int.Obiettivo.Farmaco anteriore.Obiettivo.J Immunol Res.Tossicologia.Biol Farm Bull.SLAS Discov.Farmaco anteriore.Cancro ris.Clin Lab Med.Arch Pathol Lab Med.Nat Rev Cancro.Mol Cancro Ris.Anna Oncol.Anna Oncol.Complemento BMC Altern Med.Biochimica cellulare.Cancro Med.Vita IUBMB.2018.Tumore Biol.Int J Oncol.Interazione chimica biologica.Obiettivo.Obiettivi dei farmaci contro il cancro di Curr.Biol Farm Bull.Fitoterapia.Immunolo Int.PLoS uno.J Biol Chem.J Mol Med (Berlino).Mol Oncol.N inglese J Med.Questo lavoro è pubblicato e concesso in licenza da Dove Medical Press Limited.I termini completi di questa licenza sono disponibili su https://www.dovepress.com/terms.php e incorporano la licenza Creative Commons Attribution - Non Commercial (unported, v3.0).Accedendo all'opera accetti i Termini.Gli usi non commerciali dell'opera sono consentiti senza ulteriore autorizzazione da parte di Dove Medical Press Limited, a condizione che l'opera sia adeguatamente 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