Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.La suddetta percentuale di manoscritti è stata respinta negli ultimi 12 mesi.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via e-mail.Torna a Diari » OncoTargets and Therapy » Volume 12Gli effetti e i meccanismi di un ginsenoside biosintetico 3β,12β-Di-O-Glc-PPD sul carcinoma polmonare non a piccole celluleAutori Huang LL, Tang M, Du QQ, Liu CX, Yan C, Yang JL, Li YPubblicato il 9 settembre 2019 Volume 2019:12 Pagine 7375—7385DOI https://doi.org/10.2147/OTT.S217039Revisione tramite revisione tra pari anonima singolaEditore che ha approvato la pubblicazione: Dr Leo Jen-Liang SuLu-Lu Huang,1,2 Mei Tang,1,2 Qian-Qian Du,1,2 Chun-Xia Liu,1,2 Chen Yan,2 Jin-Ling Yang,3 Yan Li1,21Dipartimento di Farmacologia, Beijing Key Laboratory of New Drug Mechanisms and Pharmacological Evaluation Study, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, People's Republic of China;2Dipartimento di Farmacologia, Istituto di Materia Medica, Accademia Cinese di Scienze Mediche e Collegio Medico dell'Unione di Pechino, Pechino 100050, Repubblica Popolare Cinese;3Dipartimento di biosintesi, Laboratorio chiave di stato della sostanza bioattiva e funzione delle medicine naturali e Laboratorio chiave di biosintesi dei prodotti naturali della Commissione nazionale per la salute e la pianificazione familiare, Accademia cinese di scienze mediche e Collegio medico dell'Unione di Pechino, Pechino, 100050, Repubblica popolare cinese Corrispondenza: Yan Li Institute of Materia Medica, Accademia cinese di scienze mediche e Peking Union Medical College, 1 Xian Nong Tan Street, Pechino 100050, Repubblica popolare cinese Tel +86 10 6316 9181 Email [e-mail protetta] Sfondo: un ginsenoside biosintetico, Il 3-O-β-D-glucopiranosil-12-O-β-D-glucopiranosil-dammar-24-ene-3β, 12β, 20S-triolo (C3C12PPD), ha mostrato un'attività antitumorale contro molte cellule tumorali in vitro, in particolare era migliore attività antitumorale rispetto a Rg3 in vitro e in vivo.Tuttavia, gli effetti ei meccanismi molecolari di C3C12PPD sul cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC) rimangono poco chiari.Secondo studi precedenti, abbiamo ipotizzato che il ginsenoside C3C12PPD potesse inibire la crescita tumorale del NSCLC prendendo di mira la proliferazione, la migrazione e l'angiogenesi.Metodi: Per valutare la vitalità cellulare è stato eseguito un saggio di tiazolil blu tetrazolio bromuro (MTT).Inoltre, sono stati condotti saggi Transwell e di formazione di tubi per analizzare la migrazione cellulare e l'angiogenesi.Gli esperimenti di xenotrapianto tumorale di Lewis e A549 sono stati eseguiti anche per studiare gli effetti di C3C12PPD sulla crescita del tumore in vivo, sono stati eseguiti il ​​test Western blotting e IHC per analizzare l'espressione proteica.Risultati: C3C12PPD potrebbe inibire efficacemente la proliferazione e la migrazione delle cellule tumorali del polmone e la formazione di tubi della cellula EA.hy926.Il ginsenoside C3C12PPD ha soppresso la crescita del tumore di Lewis e A549 in vivo senza effetti collaterali evidenti sul peso corporeo e sull'indice ematologico.Inoltre, l'analisi Western blot ha rivelato che gli effetti di C3C12PPD sul cancro del polmone erano mediati dall'inibizione delle vie di segnalazione di Raf/MEK/ERK, AKT/mTOR e AKT/GSK-3β/β-catenina.Infine, C3C12PPD potrebbe inibire significativamente l'indice di proliferazione e il numero di vasi nei tumori dello xenotrapianto di Lewis analizzati dall'IHC.Conclusione: i risultati del presente studio suggeriscono che il ginsenoside C3C12PPD può fungere da potenziale composto candidato terapeutico contro il NSCLC.Parole chiave: C3C12PPD, NSCLC, Raf/MEK/ERK, AKT/mTOR, AKT/GSK-3β/β-cateninaIl cancro del polmone rimane la principale causa di incidenza e mortalità per cancro in tutto il mondo, con 2,1 milioni di nuovi casi di cancro ai polmoni e 1,8 milioni di decessi previsti nel 2018, che rappresentano quasi 1 decesso globale su 5 (18,4%) e circa l'80% di tutti i tumori del polmone casi che si presentano come NSCLC.1,2 Nonostante i recenti progressi nel trattamento del NSCLC, la prognosi e il tempo di sopravvivenza rimangono insoddisfacenti, ci sono crescenti richieste di strategie terapeutiche innovative per ridurre la mortalità del NSCLC.3L'uso del Panax ginseng nella medicina tradizionale cinese risale a circa 5000 anni fa e la farmacopea di Giappone, Corea, USA, Canada, Germania, Regno Unito, Francia e Austria ne riconosce la capacità di ripristinare la vitalità.4,5 Negli ultimi anni, il la ricerca sul P. ginseng è aumentata rapidamente.I ginsenosidi, isolati dal ginseng, hanno varie proprietà benefiche, tra cui anticancro, neuroprotezione, cardioprotezione, potenziamento dell'immunità.5-7 Tra questi, il ginsenoside Rg3, ginsenoside di tipo protopanaxadiolo (PPD), è stato sviluppato come nuovo farmaco per il cancro. 8,9 I ricercatori hanno lavorato molto per modificare la struttura del ginsenoside Rg3 per migliorare l'attività biologica, la biodisponibilità e alleviare la tossicità.C3C12PPD, uno dei nuovi ginsenosidi, ha lo stesso peso molecolare e numero di parti zuccherine dell'Rg3, è stato prodotto dalla semisintesi chimica circa 20 anni fa e potrebbe essere prodotto su larga scala dalla fermentazione microbica dal 2017. Studi precedenti hanno dimostrato che il ginsenoside C3C12PPD ha mostrato una notevole attività contro diverse linee cellulari tumorali umane e un'attività antitumorale più elevata rispetto a Rg3.10-12 Tuttavia, ulteriori effetti e meccanismi di C3C12PPD sull'NSCLC sono scarsamente riportati.Secondo gli studi sui ginsenosidi,13,14 abbiamo ipotizzato che il C3C12PPD possa inibire la proliferazione, la migrazione e l'angiogenesi del NSCLC mediato dalle vie di segnalazione di Raf/MEK/ERK, AKT/mTOR e AKT/GSK-3β/β-catenina.I ginsenosidi hanno mostrato un'eccellente attività antitumorale nelle linee cellulari p53-wildtype, quindi in questo studio abbiamo scelto le linee cellulari NSCLC p53-wildtype LLC e A549.9,15-17 Abbiamo valutato gli effetti di C3C12PPD su NSCLC in vitro e in vivo, ne abbiamo esplorato il possibile meccanismi e sperano di fornire una base sperimentale per il suo ulteriore studio.Le linee cellulari endoteliali della vena ombelicale umana EA.hy926, le linee cellulari di cancro del polmone umano NCI-H1650, NCI-H1975, NCI-H460 e A549 e le linee cellulari di cancro del polmone murino LLC sono state acquistate dal centro cellulare dell'Accademia cinese di scienze mediche e beccare Union Medical College (Pechino, Cina).Le cellule EA.hy926, NCI-H1975 e LLC sono state coltivate nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM, Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA), le cellule NCI-H1650, NCI-H460 e A549 sono state coltivate in RPMI-1640 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.).Tutte le colture cellulari sono state integrate con siero bovino fetale al 10% (FBS; YHSM, Pechino, Cina), 100 IU/mL di penicillina e 100 µg/mL di streptomicina.Tutte le linee cellulari sono state incubate a 37°C con il 5% di CO2.Il C3C12PPD è stato fornito dall'Institute of Materia Medica, dall'Accademia cinese delle scienze mediche e dal Peking Union Medical College (purezza HPLC >98%).Taxol è stato ottenuto dalla Beijing Union Pharmaceutical Factory (Pechino, Cina).Secondo il riferimento, C3C12PPD è stato sciolto in dimetilsolfossido (DMSO) in esperimenti in vitro ed è stato sciolto in una soluzione al 25% di PEG400 in esperimenti in vivo.10 Per gli esperimenti in vivo, Taxol è stato diluito allo 0,9% di NaCl prima dell'uso.Le linee cellulari NCI-H1650, NCI-H1975, NCI-H460, A549 e LLC sono state seminate in una piastra da 96 pozzetti.Dopo incubazione per 24 ore, le cellule sono state trattate con varie concentrazioni (4,0 µmol/L, 20,0 µmol/L, 100,0 µmol/L e 500,0 µmol/L) di C3C12PPD o DMSO come veicolo.Dopo l'incubazione per 120 ore, a ciascun pozzetto è stato aggiunto un totale di 50 µl di soluzioni madre MTT (2 mg/mL, Solarbio, Pechino, Cina).Le piastre da 96 pozzetti sono state successivamente incubate per altre 4 ore a 37°C.Il mezzo è stato sostituito con DMSO (Biosharp, Inc., Hefei, Cina; 150 µL/pozzetto), dopo una leggera agitazione, è stato utilizzato un lettore ELISA (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) per misurare l'assorbanza a 570 nm .Tre campioni paralleli sono stati misurati in ciascuna linea cellulare.I valori di assorbanza sono stati normalizzati ai valori ottenuti per le cellule trattate con veicolo per determinare la percentuale di cellule sopravvissute.La concentrazione inibitoria mediana (IC50) è stata valutata dalla curva dose-risposta.10 L'esperimento è stato ripetuto tre volte.Il test di migrazione cellulare è stato eseguito utilizzando inserti Transwell contenenti filtri in policarbonato con pori da 8,0 µm.Le cellule (1 × 106 cellule/pozzetto) sono state sospese in 200 µL di albumina di siero bovino allo 0,1% (BSA, Solarbio, Pechino, Cina) con o senza le diverse concentrazioni di C3C12PPD e sono state seminate nella camera superiore;un totale di 600 µl di mezzo normale con il 10% di FBS è stato posto nelle camere inferiori.Dopo 18 ore di incubazione in 5% CO2 a 37°C, le cellule sul lato inferiore della camera sono state fissate con metanolo e colorate con ematossilina ed eosina (H&E) e fotografate in 4 campi selezionati casualmente (ingrandimento × 400, Olympus IX70 , Olympus Corporation, Tokyo, Giappone).È stato contato il numero di cellule migrate nei 4 campi selezionati casualmente di ciascuna membrana e sono stati misurati 3 campioni paralleli per ciascuna linea cellulare.Un totale di 5.000 cellule EA.hy926, che erano state trattate o non trattate con C3C12PPD, sono state seminate in una piastra da 96 pozzetti pre-rivestita con Matrigel.Dopo l'incubazione a 37°C per 5 ore, le cellule EA.hy926 sono state esaminate per la formazione di tubi capillari e fotografate al microscopio (ingrandimento × 100, Olympus IX70, Olympus Corporation).Sono stati analizzati tre campioni paralleli per ciascuna concentrazione.Tutti gli studi sugli animali erano conformi alle politiche dell'Institute of Material Medical Animal Care and Use Committee.Tutti i protocolli sugli animali erano conformi alle Linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Accademia cinese delle scienze mediche e del Peking Union Medical College.I topi C57BL/6 (maschi, 16–18 g) sono stati acquistati da BEIJING HFK BIOSCIENCE CO., LTD (Pechino, Cina).Le cellule LLC sono state raccolte e lavate 3 volte con soluzione fisiologica normale.Le cellule sono state contate e diluite a 5×107 cellule/mL.I topi C57BL/6 sono stati impiantati per via sottocutanea con 0,2 mL di sospensione cellulare nel fianco sinistro.Dopo 24 ore di inoculazione, i topi C57BL/6 sono stati divisi casualmente in 3 gruppi, 5 animali in ciascun gruppo.Un gruppo ha ricevuto una sonda gastrica (po) del 25% PEG400 come controllo del modello.Un altro gruppo ha ricevuto un'iniezione intraperitoneale di 15,0 mg/kg di Taxol (due volte a settimana) e un altro gruppo ha ricevuto PO di 10,0 mg/kg di C3C12PPD per 10 giorni.Quando il volume del tumore del gruppo di controllo era di circa 2000 mm3, i topi sono stati sottoposti a eutanasia e i tumori sono stati asportati, pesati e fotografati.Il tasso di inibizione (IR) della crescita del tumore è stato calcolato utilizzando la seguente formula: IR (%) = [(A - B)/A]/100, dove A è il peso medio del tumore del modello di controllo, B è il peso medio del tumore dei gruppi di trattamento.I tessuti tumorali sono stati conservati a –80°C per le analisi successive.I topi nudi BALB/c/nu (maschi, 15–19 g) sono stati acquistati dall'IFDC Institute for Laboratory Animal Resources (Pechino, Cina).Le cellule A549 (1×107) sono state impiantate per via sottocutanea nel fianco sinistro di ciascun topo.Quando i tumori sono cresciuti fino a ~ 200 mm3, i topi portatori di tumore sono stati separati casualmente in tre gruppi, 5 animali in ciascun gruppo.Un gruppo ha ricevuto po di PEG400 al 25% come gruppo di controllo modello, un altro gruppo ha ricevuto un'iniezione intraperitoneale di 25,0 mg/kg di taxolo (due volte a settimana) e il restante gruppo ha ricevuto po di 10,0 mg/kg di C3C12PPD per 10 giorni.La dimensione del tumore è stata misurata con calibri a corsoio due volte a settimana.Quando il volume del tumore del gruppo di controllo era di circa 1500 mm3, i topi sono stati sottoposti a eutanasia e i tumori sono stati asportati, pesati e fotografati.18 Volume del tumore = larghezza × larghezza × lunghezza/2, volume del tumore relativo (RTV) = Vt/V0 ( Vt: il volume del tumore misurato ogni volta, V0: il volume iniziale).I tessuti tumorali sono stati conservati a –80°C per le analisi successive.Tessuti raggruppati da 3 tumori selezionati casualmente dai topi xenotrapianti Lewis del controllo, gruppi 15,0 mg/kg Taxol e 10,0 mg/kg C3C12PPD;e i topi xenotrapianti A549 del gruppo di controllo, 25,0 mg/kg di Taxol e 10,0 mg/kg di gruppi C3C12PPD;Le cellule LLC e A549 che erano state trattate con varie concentrazioni di C3C12PPD per 72 ore, sono state lisate usando il tampone RIPA per 40 minuti su ghiaccio.Successivamente, i lisati cellulari dei suddetti gruppi sono stati centrifugati a 12.000 rpm per 30 minuti a 4°C.I lisati nucleari sono stati preparati secondo il protocollo del kit di estrazione nucleare e citoplasmatica (Pechino ComWin Biotech Co., Ltd., Pechino, Cina).Le concentrazioni di proteine ​​sono state determinate mediante saggio BCA.Un totale di 40 μg di proteine ​​​​sono state caricate per corsia, quindi separate su SDS-PAGE e quindi trasferite su una membrana di nitrocellulosa da 0,4 μm (Bio-Rad Laboratories, Inc.).Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% in TBST per 2 ore a 25°C, quindi sono state incubate per una notte a 4°C con gli anticorpi primari (anticorpo VEGF, Abcam; gli anticorpi rimanenti sono stati acquistati da Cell Signaling Technology, Inc. , Danvers, MA USA).Dopo tre lavaggi con soluzione salina tamponata con Tris contenente l'1% di Tween®-20 (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), le membrane sono state incubate con IgG anti-coniglio o anti-topo coniugato con perossidasi di rafano (Biotecnologia di Santa Cruz , Inc.) e misurato utilizzando un sistema di rilevamento e analisi Western blot ECL (Applygen Technologies Inc., Pechino, Cina).La β-actina è stata utilizzata come controllo del carico per le proteine ​​​​di membrana e i nuclei nucleari sono stati esaminati per un carico uguale sondando l'istone H3.La colorazione immunoistochimica è stata eseguita utilizzando sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina da 4,0 µm.Il recupero dell'antigene è stato effettuato in tampone citrato (10 mmol/L, pH 6,0) per 15 minuti a 100°C in un forno a microonde.L'attività della perossidasi endogena è stata bloccata con perossido di idrogeno al 3% in acqua per 30 minuti.Le sezioni di tessuto sono state quindi lavate in 1 × PBS e pre-bloccate con siero bovino fetale per 30 minuti.I vetrini sono stati incubati con un anti-PCNA primario di coniglio (ab18197, Abcam, Cambridge, UK), anti-CD34 di coniglio (ab81289, Abcam) durante la notte a 4°C.Le sezioni sono state quindi incubate con IgG anti-coniglio secondario biotinilato (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Pechino, Cina) per 1 ora.Dopo il lavaggio con 1 × PBS, le sezioni di tessuto sono state incubate con il reagente Vectatain ABC (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA).Il complesso immunitario è stato visualizzato utilizzando una soluzione di substrato DAB (Santa Cruz Biotechnology, Inc.).Ciascuna sezione è stata esaminata con un ingrandimento di × 200 e analizzata con ImageJ Launcher (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).19I dati sono espressi come media ± la deviazione standard.L'analisi statistica per esaminare le differenze tra due gruppi è stata eseguita utilizzando un test t di Student spaiato e per esaminare le differenze tra più gruppi è stata eseguita utilizzando un'ANOVA unidirezionale e il test post hoc di Dunnett.Si è ritenuto che P<0,05 indicasse una differenza statisticamente significativa.Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando Microsoft Excel 2016.0 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) e GraphPad Prism 5.01 (La Jolla, CA, USA).L'effetto inibitorio della crescita di C3C12PPD è stato valutato in un pannello di 5 linee cellulari di cancro del polmone utilizzando il test MTT.È stata osservata un'inibizione della vitalità cellulare dopo il trattamento con C3C12PPD per 120 ore, con valori di IC50 compresi tra 60 µmol/L e 260 µmol/L (Tabella 1).Tabella 1 L'effetto di C3C12PPD sulla proliferazione delle cellule tumorali del polmoneTabella 1 L'effetto di C3C12PPD sulla proliferazione delle cellule tumorali del polmoneIl test Transwell è stato eseguito per valutare l'effetto di C3C12PPD sulla capacità di migrazione delle cellule LLC e A549 NSCLC.Come presentato nelle Figure 1A e B, C3C12PPD potrebbe inibire la migrazione cellulare in modo dipendente dalla concentrazione.I tassi di inibizione erano rispettivamente del 37,4% e del 71,1% in cellule NSCLC di topo LLC trattate con C3C12PPD da 100,0 µmol/L e 200,0 µmol/L (Figura 1A).Inoltre, la migrazione cellulare è stata ridotta del 34,6% e del 42,9% dopo il trattamento con 50,0 e 100,0 µmol/L C3C12PPD rispettivamente, in cellule NSCLC umane A549 (Figura 1B).La proliferazione delle cellule LLC e A549 non è stata significativamente influenzata dalle suddette concentrazioni di C3C12PPD, poiché i tassi inibitori erano inferiori al 20% a 24 ore per le cellule LLC e A549.Presi insieme, questi dati hanno suggerito che C3C12PPD potrebbe ridurre la capacità di migrazione delle cellule LLC e A549.Figura 1 Effetti di C3C12PPD sulla migrazione di cellule LLC e A549.Le capacità di migrazione delle cellule LLC e A549 sono state misurate dopo il trattamento con diverse concentrazioni di C3C12PPD.Un numero uguale di cellule LLC (A) e A549 (B) è stato seminato nel compartimento superiore di un Transwell e lasciato trasferire attraverso filtri in policarbonato per 18 ore.Le cellule migrate sono state fissate e contate.Le cellule trattate con C3C12PPD hanno mostrato una diminuzione della migrazione rispetto alle cellule di controllo.Ogni campione è stato eseguito in triplicato.Le barre di errore rappresentano la deviazione standard.*P<0,05, ***P<0,001 rispetto alle cellule di controllo.Figura 1 Effetti di C3C12PPD sulla migrazione di cellule LLC e A549.Le capacità di migrazione delle cellule LLC e A549 sono state misurate dopo il trattamento con diverse concentrazioni di C3C12PPD.Un numero uguale di cellule LLC (A) e A549 (B) è stato seminato nel compartimento superiore di un Transwell e lasciato trasferire attraverso filtri in policarbonato per 18 ore.Le cellule migrate sono state fissate e contate.Le cellule trattate con C3C12PPD hanno mostrato una diminuzione della migrazione rispetto alle cellule di controllo.Ogni campione è stato eseguito in triplicato.Le barre di errore rappresentano la deviazione standard.*P<0,05, ***P<0,001 rispetto alle cellule di controllo.La presenza di vasi sanguigni è associata alla malignità e all'aggressività del cancro del polmone.19 Pertanto, è stato utilizzato un test di formazione del tubo cellulare EA.hy926 per esaminare l'effetto di C3C12PPD sull'angiogenesi.Come illustrato nella Figura 2, con 100,0 µmol/L e 200,0 µmol/L C3C12PPD somministrati per 5 ore, la lunghezza del tubo è stata notevolmente ridotta rispettivamente del 77,5% (P<0,001) e dell'88,2% (P<0,001).Inoltre, la proliferazione delle cellule EA.hy926 non è stata influenzata dalle suddette concentrazioni, il tasso di inibizione della proliferazione era del 16,0 ± 4,2% a 24 ore per le cellule EA.hy926.Questi dati hanno dimostrato che C3C12PPD potrebbe inibire significativamente la formazione di tubi di cellule EA.hy926.Figura 2 Effetto di C3C12PPD sulla formazione del tubo delle cellule EA.hy926.La formazione del tubo delle cellule EA.hy926 è stata inibita dopo il trattamento di C3C12PPD per 5 ore.Le barre di errore rappresentano la deviazione standard.*P<0,05, ***P<0,001 rispetto alle cellule di controllo.Figura 2 Effetto di C3C12PPD sulla formazione del tubo delle cellule EA.hy926.La formazione del tubo delle cellule EA.hy926 è stata inibita dopo il trattamento di C3C12PPD per 5 ore.Le barre di errore rappresentano la deviazione standard.*P<0,05, ***P<0,001 rispetto alle cellule di controllo.Negli xenotrapianti di Lewis, la crescita del tumore è stata soppressa nei topi trattati con 10,0 mg/kg di C3C12PPD, con il tasso di inibizione del tumore al 51,7% in base al peso del tumore (Tabella 2, Figura 3A1).Negli xenotrapianti A549, il tasso di inibizione del tumore era del 33,6% con 10,0 mg/kg di C3C12PPD in base al peso del tumore, mentre il rapporto di volume T/C (trattamento/controllo) era del 60,1% (Tabella 3, Figura 3B1 e B2), suggerendo che C3C12PPD può inibire la crescita del tumore nei modelli di xenotrapianto NSCLC Lewis e A549.Tabella 2 L'effetto di C3C12PPD sulla crescita del tumore nel modello di xenotrapianto NSCLC di topo LewisFigura 3 Gli effetti di C3C12PPD sulla crescita di xenotrapianti Lewis e A549 NSCLC.L'attività di C3C12PPD è stata determinata in xenotrapianti di NSCLC di topo Lewis in topi C57BL/6 e in xenotrapianti di NSCLC umano A549 in topi nudi BALB/c/nu.Gli animali sono stati divisi casualmente in tre gruppi.Il dosaggio di C3C12PPD era 10,0 mg/kg.C'erano 5 topi portatori di tumore indipendenti in ciascun gruppo.(A) Il peso del tumore corrispondente (A1) e il peso corporeo medio ± SD in diversi punti temporali (A2) per gli xenotrapianti di Lewis.(B) Il peso del tumore corrispondente (B1), il volume medio e l'RTV media (volume del tumore relativo = Vt/V0) ± SD (B2) e il peso corporeo medio ± SD in diversi momenti (B3) per xenotrapianti A549.Tabella 3 L'effetto di C3C12PPD sulla crescita tumorale del NSCLC umano A549 nel topo atimicoTabella 2 L'effetto di C3C12PPD sulla crescita del tumore nel modello di xenotrapianto NSCLC di topo LewisFigura 3 Gli effetti di C3C12PPD sulla crescita di xenotrapianti Lewis e A549 NSCLC.L'attività di C3C12PPD è stata determinata in xenotrapianti di NSCLC di topo Lewis in topi C57BL/6 e in xenotrapianti di NSCLC umano A549 in topi nudi BALB/c/nu.Gli animali sono stati divisi casualmente in tre gruppi.Il dosaggio di C3C12PPD era 10,0 mg/kg.C'erano 5 topi portatori di tumore indipendenti in ciascun gruppo.(A) Il peso del tumore corrispondente (A1) e il peso corporeo medio ± SD in diversi punti temporali (A2) per gli xenotrapianti di Lewis.(B) Il peso del tumore corrispondente (B1), il volume medio e l'RTV media (volume del tumore relativo = Vt/V0) ± SD (B2) e il peso corporeo medio ± SD in diversi momenti (B3) per xenotrapianti A549.Tabella 3 L'effetto di C3C12PPD sulla crescita tumorale del NSCLC umano A549 nel topo atimicoDurante il corso del trattamento, la perdita di peso (Figura 3A2 e B3), segni di disagio e mortalità non sono stati osservati nei gruppi di trattamento C3C12PPD.Nei modelli di xenotrapianto Lewis e A549, 10,0 mg/kg di C3C12PPD non hanno causato riduzioni significative degli indici ematologici tipici, come globuli bianchi (WBC), globuli rossi (RBC), emoglobina (HGB) e RBC e HGB significativamente aumentati in Modello di xenotrapianto di Lewis (Tabelle 4 e 5).Questi risultati hanno indicato che 10,0 mg/kg di C3C12PPD potrebbero inibire la crescita del tumore senza un'evidente tossicità nei topi.Tabella 4 Gli effetti di C3C12PPD sulla conta dei globuli periferici nel modello di xenotrapianto NSCLC di topo LewisTabella 5 Gli effetti di C3C12PPD sulla conta dei globuli periferici nel modello di xenotrapianto di NSCLC umano A549Tabella 4 Gli effetti di C3C12PPD sulla conta dei globuli periferici nel modello di xenotrapianto NSCLC di topo LewisTabella 5 Gli effetti di C3C12PPD sulla conta dei globuli periferici nel modello di xenotrapianto di NSCLC umano A549Le vie di segnalazione Raf/MEK/ERK, AKT/mTOR e AKT/GSK-3β/β-catenina controllano le risposte cellulari chiave, come la crescita cellulare, la proliferazione, l'angiogenesi e la migrazione.20–22 Pertanto, il presente studio ha rilevato l'espressione di proteine ​​associate a questi percorsi nelle cellule LLC e A549 NSCLC e nei tumori trattati con C3C12PPD.Dopo che le cellule LLC e A549 sono state trattate con C3C12PPD per 72 ore a 100,0 µmol/L, C3C12PPD potrebbe inibire efficacemente la fosforilazione c-Raf e le sue proteine ​​a valle p-MEK, p-ERK e p-AKT (Figura 4A).Poiché mTOR è uno degli obiettivi di AKT, p-mTOR e le sue proteine ​​a valle HIF-1α, sono stati rilevati anche VEGF,23,24 ed è stato osservato che erano sottoregolati di 100,0 µmol/L C3C12PPD (Figura 4B).Alla concentrazione di 100,0 µmol/L C3C12PPD, sono stati inibiti anche i livelli di proteina totale c-Raf, AKT, mTOR, tranne che la proteina totale di MEK nelle cellule A549 è rimasta stabile (Figura 4A e 4B).Figura 4 Gli effetti di C3C12PPD sui biomarcatori relativi alle vie Raf/MEK/ERK (A), AKT/mTOR (B) e AKT/GSK-3β/β-catenina (C) nelle cellule LLC e A549 NSCLC.Cellule LLC e A549 dopo il trattamento con concentrazioni indicate di C3C12PPD per 72 ore e sono state eseguite con anticorpi diversi.Ogni Western blotting è stato eseguito almeno due volte.La β-actina e l'istone H3 sono stati usati come controllo del carico.*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 rispetto al controllo.Figura 4 Gli effetti di C3C12PPD sui biomarcatori relativi alle vie Raf/MEK/ERK (A), AKT/mTOR (B) e AKT/GSK-3β/β-catenina (C) nelle cellule LLC e A549 NSCLC.Cellule LLC e A549 dopo il trattamento con concentrazioni indicate di C3C12PPD per 72 ore e sono state eseguite con anticorpi diversi.Ogni Western blotting è stato eseguito almeno due volte.La β-actina e l'istone H3 sono stati usati come controllo del carico.*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 rispetto al controllo.L'inattivazione di p-AKT ha portato anche alla diminuzione di p-GSK-3β e β-catenina nelle cellule LLC e A549 trattate con 50,0 µmol/L o 100,0 µmol/L C3C12PPD per 72 ore.Anche le proteine ​​c-MYC, LEF1 e MMP2, a valle della β-catenina, sono state notevolmente ridotte.Il livello di GSK-3β nelle cellule NSCLC LLC è stato significativamente inibito, mentre la riduzione non era evidente nelle cellule NSCLC A549 (Figura 4C).C3C12PPD potrebbe non solo inibire le vie di segnalazione di Raf/MEK/ERK, AKT/mTOR e AKT/GSK-3β/β-catenina nelle cellule NSCLC, ma anche nei tessuti tumorali.Nei tumori xenotrapianti Lewis e A549 somministrati con 10,0 mg/kg di C3C12PPD, i livelli di pc-Raf e proteine ​​a valle p-MEK, p-ERK e p-AKT erano significativamente inferiori rispetto al controllo.Tuttavia, il livello delle proteine ​​​​totali non mostrava molte differenze tra i gruppi trattati con C3C12PPD e quelli di controllo, tranne per il fatto che ERK dei tumori xenotrapianti A549 era significativamente ridotto (Figura 5A).Figura 5 Gli effetti di C3C12PPD sui biomarcatori correlati alle vie Raf/MEK/ERK (A), AKT/mTOR (B) e AKT/GSK-3β/β-catenina (C) nei tumori di Lewis e A549 xenotrapianto.Sono stati riuniti tre lisati di un gruppo.In questo test Western blot, ogni corsia rappresentava un pool di proteine ​​e c'erano tre pool per ciascun gruppo.La β-actina e l'istone H3 sono stati usati come controllo del carico.Le macchie sono state incubate con diversi anticorpi.Sono state mostrate macchie rappresentative.Gli esperimenti sono stati ripetuti almeno due volte.*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 rispetto al controllo.Figura 5 Gli effetti di C3C12PPD sui biomarcatori correlati alle vie Raf/MEK/ERK (A), AKT/mTOR (B) e AKT/GSK-3β/β-catenina (C) nei tumori di Lewis e A549 xenotrapianto.Sono stati riuniti tre lisati di un gruppo.In questo test Western blot, ogni corsia rappresentava un pool di proteine ​​e c'erano tre pool per ciascun gruppo.La β-actina e l'istone H3 sono stati usati come controllo del carico.Le macchie sono state incubate con diversi anticorpi.Sono state mostrate macchie rappresentative.Gli esperimenti sono stati ripetuti almeno due volte.*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 rispetto al controllo.L'espressione di p-mTOR, mTOR, HIF-1α e VEGF è stata significativamente ridotta nel gruppo C3C12PPD di 10,0 mg/kg rispetto al controllo (Figura 5B).Inoltre, nei tumori xenotrapianti Lewis e A549, p-GSK-3β, β-catenina, LEF1, c-MYC e MMP2 sono stati sottoregolati dopo la somministrazione di 10,0 mg/kg di C3C12PPD.Il livello di GSK-3β non è ovviamente diminuito (Figura 5C).Presi insieme, questi risultati indicano che l'efficacia antitumorale di C3C12PPD può essere associata all'inibizione delle vie di segnalazione Raf/MEK/ERK, AKT/mTOR e AKT/GSK-3β/β-catenina.Il test immunoistochimico è stato condotto per identificare l'alterazione di PCNA e CD34 nei tessuti tumorali di Lewis.Il PCNA è un marcatore per le cellule proliferanti e il CD34 è un biomarcatore delle cellule endoteliali vascolari nelle sezioni tumorali.25 I risultati dell'IHC si sono presentati con una forte colorazione di PCNA e CD34 nel gruppo di controllo, mentre il gruppo C3C12PPD ha mostrato una debole colorazione di PCNA e CD34 nel modello di xenotrapianto di Lewis ( figura 6).Gli indici di proliferazione erano rispettivamente del 20,6±1,4% e dell'8,5±1,9% nei gruppi di controllo e trattati con C3C12PPD.L'MVD (numero totale della nave in quattro campi) era rispettivamente del 13,7±5,4% e del 4,7±0,3% nei gruppi di controllo e C3C12PPD.Questi risultati hanno indicato che C3C12PPD era efficace nell'inibire la proliferazione del tumore e l'angiogenesi.Figura 6 Rilevamento dell'espressione di PCNA e CD34 nei tessuti di xenotrapianto tumorale di Lewis analizzati mediante immunoistochimica.C3C12PPD ha inibito la proliferazione del tumore di Lewis valutata mediante colorazione con PCNA.Una diminuzione della MVD è stata trovata nei tessuti tumorali di Lewis trattati con C3C12PPD valutati mediante colorazione con CD34.*P<0,05, ***P<0,001 rispetto al controllo.Figura 6 Rilevamento dell'espressione di PCNA e CD34 nei tessuti di xenotrapianto tumorale di Lewis analizzati mediante immunoistochimica.C3C12PPD ha inibito la proliferazione del tumore di Lewis valutata mediante colorazione con PCNA.Una diminuzione della MVD è stata trovata nei tessuti tumorali di Lewis trattati con C3C12PPD valutati mediante colorazione con CD34.*P<0,05, ***P<0,001 rispetto al controllo.C3C12PPD, un ginsenoside che può essere prodotto su larga scala dalla biosintesi, ha una migliore attività antitumorale rispetto a Rg3 ed è un candidato promettente per la scoperta di farmaci antitumorali.10,11 Tuttavia, i rapporti sui meccanismi di C3C12PPD contro NSCLC sono rari, il che può limitarne lo sviluppo di farmaci.Nel presente studio, abbiamo esaminato gli effetti di C3C12PPD sulla linea cellulare di topo NSCLC LLC e sulla linea cellulare di NSCLC umano A549 in vitro e in vivo, e ne abbiamo esplorato i meccanismi alla base per creare una base sperimentale per le sue proprietà farmacologiche.I risultati hanno dimostrato che C3C12PPD potrebbe inibire la proliferazione e la migrazione nel topo LLC e nelle cellule NSCLC umane A549 e sopprimere la formazione di tubi nelle cellule EA.hy926.Inoltre, abbiamo utilizzato il modello di xenotrapianto Lewis NSCLC con 2 volte per scegliere il dosaggio adatto di C3C12PPD per esperimenti in vivo prima di questo studio e abbiamo scoperto che 10,0 mg/kg di C3C12PPD avevano un'attività inibitoria migliore di 2,5 mg/kg, 5,0 mg/kg e 20,0 mg/kg C3C12PPD.Inoltre, 10,0 mg/kg di C3C12PPD hanno anche inibito significativamente la crescita del tumore nel modello di xenotrapianto di NSCLC umano A549.La proliferazione cellulare illimitata, l'angiogenesi e la migrazione sono associate alla mortalità del NSCLC.La via di segnalazione Raf/MEK/ERK gioca un ruolo importante nella tumorigenesi e nella progressione.26,27 Nel presente studio, C3C12PPD ha inibito significativamente pc-Raf, p-MEK e p-ERK nelle cellule NSCLC e nei tessuti tumorali, suggerendo che C3C12PPD inibiva crescita tumorale di NSCLC in parte attraverso l'inibizione dell'attività della via Raf/MEK/ERK.È stato confermato che le vie di segnalazione AKT/mTOR e AKT/GSK-3β/β-catenina sono associate alla proliferazione, metastasi e angiogenesi delle cellule tumorali.20,28,29 L'inibizione di pc-Raf porta anche all'inibizione di p- AKT, ha quindi ridotto il livello delle proteine ​​a valle, p-mTOR, HIF-1α e VEGF, che sono associate alla migrazione e all'angiogenesi.24 Inoltre, l'inibizione di p-AKT ha anche ridotto il livello di p-GSK-3β, β -Catenina, così come le sue proteine ​​a valle c-MYC, MMP2, che si confermano coinvolte nella migrazione cellulare.30–32 I risultati ci hanno mostrato che C3C12PPD sopprimeva la crescita del tumore, l'angiogenesi e la migrazione nel NSCLC inibendo Raf/MEK/ Vie di segnalazione ERK, AKT/mTOR e AKT/GSK-3β/β-catenina.33–37 Inoltre, i risultati dell'IHC hanno anche confermato che la proliferazione del tumore e l'angiogenesi erano indebolite dopo il trattamento con C3C12PPD nei tumori dello xenotrapianto di Lewis.Inoltre, C3C12PPD ha mostrato poca tossicità sistemica alla dose di 10,0 mg/kg nei modelli di xenotrapianto Lewis e A549, senza diminuire il peso corporeo dei topi o alterare l'indice ematologico, che sono indici importanti per la valutazione iniziale della sicurezza del farmaco.38,39 Presi insieme, questi risultati suggeriscono che C3C12PPD può fungere da potente composto candidato per il trattamento del NSCLC.Questo è il primo studio a segnalare che C3C12PPD mostra un'attività anti-cancro del polmone non a piccole cellule inibendo le vie di segnalazione di Raf/MEK/ERK, AKT/mTOR e AKT/GSK-3β/β-catenina.Il nostro lavoro ha gettato le basi per la ricerca di C3C12PPD.Tuttavia, c'è ancora molto lavoro che dobbiamo fare per lo sviluppo del farmaco di C3C12PPD, compreso l'obiettivo specifico sulla sua attività antitumorale, la tossicità, le caratteristiche farmacocinetiche e così via.Ci auguriamo che lo studio possa costituire una base sperimentale per il suo ulteriore studio.C3C12PPD ha mostrato un effetto inibitorio sulla proliferazione, migrazione e angiogenesi del NSCLC e può fungere da potenziale composto candidato terapeutico contro il NSCLC.Tutti gli studi sugli animali erano conformi alle politiche dell'Institute of Material Medical Animal Care and Use Committee.Nutrienti.Tutti i diritti riservati.