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dell'espressione del tempo e dei metaboliti per identificare nuovi regolatori trascrizionali della biosintesi della camptotecina in O. pumila.Viene qui mostrato che la produzione di camptotecina è aumentata nel tempo di coltivazione e che il pattern di espressione del gene codificante per il fattore di trascrizione WRKY OpWRKY2 è strettamente correlato all'accumulo di camptotecina.La sovraespressione di OpWRKY2 ha portato a un aumento di oltre tre volte dei livelli di camptotecina.Di conseguenza, il silenziamento di OpWRKY2 è correlato alla diminuzione dei livelli di camptotecina nella pianta.Un'ulteriore caratterizzazione molecolare dettagliata mediante spostamento della mobilità elettroforetica, saggi di lievito unibrido e dual-luciferasi hanno mostrato che OpWRKY2 si lega direttamente e attiva il gene della via centrale della camptotecina OpTDC.Nel loro insieme, i risultati di questo studio dimostrano che OpWRKY2 agisce come un regolatore positivo diretto della biosintesi della camptotecina.Come tale, viene presentata una strategia fattibile per l'eccessivo accumulo di camptotecina in un sistema biotecnologicamente suscettibile.La camptotecina (CPT) è un alcaloide indolico monoterpenoide (MIA) originariamente isolato dall'albero felice cinese (Camptotheca acuminata)1.Questo prodotto naturale mostra una potente attività antitumorale inibendo la DNA topoisomerasi I1,2,3.I suoi due derivati, topotecan e irinotecan, sono stati approvati dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti per il trattamento di vari tipi di cancro4.A causa dell'ampia gamma di target dei derivati ​​CPT, la loro domanda clinica è in continuo aumento.Attualmente, lo sfruttamento commerciale della camptotecina dipende in gran parte dall'estrazione da risorse vegetali legnose naturali come C. acuminata e Nothapodytes foetida4.Tuttavia, queste piante mostrano tipicamente basse concentrazioni di camptotecina e non sono adatte alle moderne applicazioni biotecnologiche a causa dei loro lunghi cicli di crescita.Sono stati fatti diversi tentativi per stabilire robusti sistemi di coltura cellulare vegetale per fornire una piattaforma per un'elevata produzione di CPT.Tra questi ci sono colture a radice pelosa di Ophiorrhiza pumila, una pianta erbacea del genere Ophiorrhiza nella famiglia delle Rubiaceae.O. pumila produce camptotecina naturalmente in vari organi, come radici, steli e foglie5.È stato dimostrato che il sistema delle radici pelose di O. pumila produce fino allo 0,1–0,2% in peso secco di camptotecina6,7,8.Tuttavia, per migliorare ulteriormente la produzione di camptotecina in O. pumila mediante l'ingegneria biotecnologica, è fondamentale sezionare completamente il suo percorso biosintetico e il meccanismo di regolazione molecolare.Il percorso di biosintesi della camptotecina è complesso e solo in parte risolto.La biosintesi della camptotecina utilizza intermedi delle vie iridoide e shikimato, che convergono per formare la molecola strictosidina e poi ulteriormente, tramite reazioni chimiche sconosciute, formano la camptotecina (Fig. 1)4,9.La strictosidina sintasi (OpSTR) catalizza la condensazione di triptamina e secologanina per formare la strictosidina, un intermedio centrale nella via di biosintesi della camptotecina10.Geraniol-10-idrossilasi (OpG10H) e secologanin sintasi (OpSLS), due sintasi della famiglia del citocromo P450 (CYP450), sono coinvolte nella conversione del geraniolo in secologanin nella via iridoide8.La citocromo P450 reduttasi OpCPR è essenziale per l'attività di OpG10H e OpSLS e svolge un ruolo importante nel trasferimento di elettroni dalla nicotinamide adenina dinucleotide fosfato (NADPH) al citocromo P4508,10.La triptofano decarbossilasi (OpTDC) catalizza la conversione del triptofano in triptamina nella via dello shikimato5,10.Studi recenti hanno confermato che la biosintesi della camptotecina può essere manipolata prendendo di mira questi enzimi nell'ingegneria metabolica delle radici pelose di O. pumila.La soppressione di OpSLS e OpTDC ha portato a una diminuzione della produzione di camptotecina nelle radici pelose di O. pumila, corroborando così la loro importanza nella biosintesi della camptotecina11.La manipolazione dei sistemi transgenici di radici pelose ha ulteriormente evidenziato i ruoli importanti sia di OpG10H che di OpSLS nella biosintesi della camptotecina, poiché la co-sovraespressione di OpG10H e OpSLS ha aumentato i livelli di camptotecina nelle radici pelose di O. pumila8.Tuttavia, si sa meno sul meccanismo di regolazione molecolare della biosintesi della camptotecina in O. pumila.Via MVA via mevalonato, via MEP 2-C-metil-D-eritritolo 4-fosfato, IPP isopentenil difosfato, DMAPP dimetilallil difosfato, G10H geraniol-10-idrossilasi, SLS secologanin sintasi, CPR citocromo P450 reduttasi, TDC triptofano decarbossilasi, STR stenosidina sintasi.Tre frecce tratteggiate indicano che il percorso biosintetico è sconosciuto.I fattori di trascrizione WRKY (TF) sono una delle più grandi famiglie di regolatori trascrizionali nelle piante.In genere contengono uno o due domini WRKY.Questi domini sono costituiti da ~60 residui di amminoacidi e consentono il legame del DNA12,13,14.Il dominio WRKY contiene una sequenza di amminoacidi WRKYGQK altamente conservata al suo N-terminale e una struttura atipica a dito di zinco (C2H2 o C2HC) al suo C-terminale12,13,15.Negli impianti, i WRKY TF sono divisi in tre gruppi in base al numero di domini WRKY (due domini WRKY nel gruppo I e uno nel gruppo II e III) e alla struttura degli zinc finger (C2H2 nel gruppo I e II e C2HC nel gruppo III proteine)12,13.I domini WRKY generalmente riconoscono e si legano ai motivi del DNA W-box (TTGACT/C) nelle regioni target.Precedenti studi hanno dimostrato che le proteine ​​WRKY, in particolare i membri del sottogruppo WRKY III, sono coinvolte nella regolazione della biosintesi e nell'accumulo di metaboliti secondari vegetali nelle piante medicinali.Ad esempio, CrWRKY1, un sottogruppo WRKY III TF, ha un effetto regolatorio positivo sulla biosintesi degli alcaloidi indolici monoterpenoidi legando e attivando CrTDC in Catharanthus roseus16.In Artemisia annua, è stato riportato che la proteina del sottogruppo WRKY III AaWRKY1 regola positivamente la biosintesi dell'artemisinina promuovendo la trascrizione di AaADS, AaCYP71AV1 e AaDBR217.In Salvia miltiorrhiza, è stato dimostrato che il membro del sottogruppo WRKY III SmWRKY1 regola positivamente la biosintesi del tanshinone attivando il gene SmDXR15.È stato dimostrato che WsWRKY1, un TF del sottogruppo WRKY III in Withania somnifera, regola positivamente la biosintesi dei triterpenoidi attivando WsSQS e WsSQE18.Recentemente, due TF del sottogruppo WRKY III, vale a dire, OpWRKY1 e OpWRKY3, sono stati implicati nella biosintesi della camptotecina nelle radici pelose di O. pumila5,19.OpWRKY1 regola negativamente la biosintesi della camptotecina e OpWRKY3 svolge un ruolo di regolamentazione minore nella produzione di camptotecina influenzando lo sviluppo delle radici pelose di O. pumila e attivando l'espressione di OpCPR5,19.Inoltre, è stato segnalato che diversi TF di altre famiglie sono coinvolti nella regolazione della biosintesi della camptotecina.OpERF2, una proteina della famiglia ERF TF, è stata isolata e ha dimostrato di svolgere un ruolo positivo nella regolazione della biosintesi della camptotecina20.Inoltre, l'introduzione del membro MYB TF OpMYB1 nelle radici pelose di O. pumila ha ridotto la produzione di camptotecina21.In C. acuminata, un fattore di trascrizione bZIP, CaLMF, è un componente significativo di segnalazione luminosa e media la biosintesi della camptotecina regolata dalla luce22.In generale, la regolazione trascrizionale gioca un ruolo importante nella biosintesi dei metaboliti bioattivi nelle piante medicinali.In questo studio, è stata studiata sistematicamente la biosintesi della camptotecina nelle radici pelose di O. pumila in diversi stadi di crescita.Analizzando l'espressione di tutti i presunti TF WRKY di O. pumila in diversi stadi di crescita, un singolo fattore di trascrizione, OpWRKY2, è stato identificato come altamente coespresso con noti geni del percorso di biosintesi della camptotecina.La sovraespressione di OpWRKY2 nelle radici pelose di O. pumila ha comportato un aumento dei livelli di espressione di OpTDC, nonché la formazione di camptotecina e triptamina.Di conseguenza, la downregulation di OpWRKY2 ha ridotto i livelli di espressione di OpTDC e la produzione di camptotecina.La caratterizzazione biochimica ha mostrato che OpWRKY2 si lega e attiva il promotore di OpTDC in vitro e in vivo.Complessivamente, le nostre analisi hanno identificato un nuovo regolatore della biosintesi della camptotecina e un potenziale obiettivo per la bioingegneria avanzata per una maggiore produzione di un importante farmaco antitumorale.In questo studio, le piante di O. pumila sono originarie della provincia cinese del Fujian e sono state coltivate in una serra presso la Zhejiang Chinese Medical University.Le piantine di O. pumila utilizzate per l'analisi dei modelli di espressione dei tessuti e la trasformazione della radice pelosa sono state ottenute e coltivate in terreno solido B5 come riportato in precedenza7.Tre diversi tessuti di piante sterili di O. pumila di due mesi (radici, steli e foglie) sono stati raccolti separatamente per l'analisi del pattern di espressione tissutale di OpWRKY2 e OpTDC e il rilevamento del contenuto di camptotecina in diversi tessuti.Diverse linee di radici pelose di O. pumila sono state inoculate e coltivate in mezzo liquido B5 a 120 giri / min al buio a 25 ° C.Le piante di Nicotiana benthamiana utilizzate per le analisi di localizzazione subcellulare della proteina OpWRKY2 e dei saggi della dual-luciferasi (Dual-LUC) per rilevare l'attivazione di OpWRKY2 sono state coltivate in vasi contenenti una miscela di terreno e poste in una camera di crescita sotto un fotoperiodo chiaro/scuro di 16/8 h a 25 °C23.Per l'analisi del fenotipo di crescita e della produzione di camptotecina nelle radici pelose di O. pumila, 0,2 g di linee di radici pelose fresche C58C1 (infettate con Agrobacterium tumefaciens ceppo C58C1) con crescita uniforme sono state inoculate in terreno liquido B5 e coltivate per 60 giorni7,15.Le radici pelose e il mezzo di coltura sono stati raccolti a 10, 20, 30, 40, 50 e 60 giorni e utilizzati per rilevare l'espressione genica e i livelli di metaboliti.Per l'analisi dell'espressione genica OpWRKY2 in risposta agli ormoni vegetali, le linee di radice pelosa C58C1 sono state coltivate per 30 giorni e successivamente trattate con acido salicilico 50 μM (SA), gibberellina 50 μM (GA3), acido abscissico 100 μM (ABA), e 200 μM di metil jasmonato (MeJA)5.Come controllo è stato utilizzato un volume equivalente di etanolo.Le radici pelose sono state raccolte a 0, 0,5, 1, 3, 6, 9 e 12 ore dopo l'applicazione dell'ormone e immediatamente congelate in azoto liquido per ulteriori analisi quantitative della reazione a catena della polimerasi in tempo reale (qRT-PCR).L'RNA totale di tutti i campioni è stato estratto utilizzando il kit Plant RNAprep Pure (Tiangen, Pechino, Cina).La sintesi del cDNA dall'RNA totale e le analisi qRT-PCR di tutti i trascritti genici sono state eseguite come descritto in precedenza24.Il gene housekeeping OpActin in O. pumila è stato utilizzato come gene di controllo interno in qRT-PCR per la normalizzazione di tutti i campioni.Tutte le sequenze di primer gene-specifiche di tutti i geni del percorso di biosintesi della camptotecina e i geni OpWRKY utilizzati per le analisi qRT-PCR sono elencati nella Tabella S1.I valori di espressione genica relativa in tutti i campioni sono stati calcolati utilizzando il metodo 2-ΔΔCt.Tutte le analisi qRT-PCR di ciascun campione sono state eseguite per tre repliche biologiche.Le analisi bioinformatiche sono state eseguite come descritto in precedenza25.Gli omologhi WRKY sono stati identificati nelle sequenze del trascrittoma della radice di O. pumila e della radice pelosa generate dal nostro laboratorio utilizzando la ricerca del modello Markov nascosto (HMM) e il programma BLASTx con un valore E < 10-5 8,25.Le sequenze ridondanti sono state rimosse manualmente.Tutte le proteine ​​OpWRKY in O. pumila sono state allineate utilizzando il programma ClustalW con i parametri predefiniti26.L'albero filogenetico di tutte le proteine ​​OpWRKY in O. pumila è stato costruito ed eseguito utilizzando il metodo di unione dei vicini con il software MEGA527.I valori bootstrap sono stati calcolati da 1000 repliche per analizzare e valutare l'accuratezza della filogenesi.Per analizzare la localizzazione subcellulare della proteina OpWRKY2, il frame di lettura aperto (ORF) è stato amplificato mediante PCR dalla libreria di cDNA a radice pelosa di O. pumila con primer specifici del gene OpWRKY2 (Tabella S2) e inserito nel vettore di espressione vegetale modificato pHB -YFP (proteina fluorescente gialla) per generare il costrutto pHB-OpWRKY2-YFP.Come controllo negativo è stato utilizzato il costrutto pHB-YFP senza OpWRKY2.I plasmidi pHB-OpWRKY2-YFP e pHB-YFP sono stati introdotti nel ceppo di A. tumefaciens GV3101 e hanno infettato transitoriamente le cellule epidermiche di foglie di N. benthamiana di 5 settimane.I segnali YFP sono stati analizzati utilizzando un microscopio laser confocale LSM880 (Carl Zeiss, Germania) 48 ore dopo l'infezione e sono stati eseguiti tre replicati biologici per confermare i risultati come riportato in precedenza23,28.Il frammento ORF OpWRKY2 a lunghezza intera è stato amplificato con siti di restrizione Spe I e BstE II e inserito nel vettore di espressione vegetale pCAMBIA2300+ precedentemente modificato per ottenere il costrutto pCAMBIA2300+-OpWRKY2, che è stato utilizzato per la sovraespressione di OpWRKY2 nelle radici pelose di O. pumila (Fig. S1a)7,15.Il silenziamento del repressore chimerico utilizzando il dominio di repressione del motivo EAR (SRDX) è una tecnica molto comune ampiamente utilizzata per studiare la funzione dei fattori di trascrizione29.È molto utile non solo per l'analisi rapida della funzione di fattori di trascrizione ridondanti, ma anche per la manipolazione di tratti biologici attraverso la soppressione dell'espressione genica che è regolata da specifici fattori di trascrizione29.In questo studio, per esaminare ulteriormente la funzione di OpWRKY2, la sequenza di DNA che codifica per il dominio del repressore SRDX (LDLDLELRLGFA) è stata fusa al C-terminale di OpWRKY2 e inserita nel pCAMBIA2300+ modificato per generare il costrutto pCAMBIA2300+-OpWRKY2-SRDX (Fig. S1b)16,29.Come controllo è stato utilizzato il vettore vuoto pCAMBIA2300+ senza OpWRKY2.Tutti i plasmidi sono stati trasferiti nel ceppo disarmato di A. tumefaciens C58C1, che ospita il plasmide pRiA4 di Agrobacterium rhizogenes Ri, e successivamente trasformati in steli di O. pumila per generare linee di radici pelose transgeniche di O. pumila7,15.Lo screening delle colture di radici pelose trasformate è stato effettuato su piastre medie B5.Le linee transgeniche positive della radice pelosa (OpWRKY2-OE e OpWRKY2-SRDX) sono state verificate mediante amplificazione PCR del DNA genomico della radice pelosa.I primer utilizzati per l'amplificazione PCR di radici pelose transgeniche positive sono stati progettati per coprire il gene OpWRKY2 e le sequenze vettoriali parziali pCAMBIA2300+ e sono elencati nella Tabella S2.Le radici pelose transgeniche positive sono state ulteriormente inoculate e coltivate in terreno liquido B5 per 45 giorni al buio.Le linee di radici pelose raccolte sono state utilizzate per l'espressione genica e l'analisi dei metaboliti.Per una serie temporale di produzione di metaboliti in O. pumila, le radici pelose sono state raccolte ogni 10 giorni per 60 giorni.Le radici pelose di linee transgeniche, ovvero OpWRKY2-OE e OpWRKY2-SRDX, sono state raccolte dopo 45 giorni di coltivazione.Tutti i campioni sono stati essiccati a 50°C e accuratamente macinati e il mezzo liquido è stato evaporato direttamente.Questi campioni sono stati utilizzati per ulteriori misurazioni dei metaboliti.Per le misurazioni di camptotecina e triptamina, ~ 0,1 g di polvere di radice pelosa essiccata sono stati estratti con 20 mL di metanolo e sonicati per 1 ora.Dopo la centrifugazione, il supernatante è stato evaporato sotto vuoto e il materiale residuo è stato sciolto in 2,0 mL di metanolo e filtrato attraverso un filtro da 0,22 μm.L'analisi mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) degli estratti di camptotecina e triptamina è stata eseguita utilizzando un rivelatore Agilent 1260 dotato di una colonna C18 a fase inversa (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) come descritto in precedenza5,8.Le condizioni di rilevamento della camptotecina erano le seguenti: fase mobile, acetonitrile:acqua (65:35, v/v);temperatura della colonna, 30 °C;e lunghezza d'onda di rilevamento, 254 nm.Le condizioni di rilevamento della triptamina erano le seguenti: fase mobile, 43% acetonitrile:30% metanolo:26% acqua bidistillata:1% acido acetico glaciale (v/v);temperatura della colonna, 30 °C;lunghezza d'onda di rilevamento, 254 nm.Gli standard disponibili in commercio di camptotecina e triptamina (Aladdin, Shanghai, Cina) sono stati utilizzati per l'identificazione e la quantificazione comparativa come descritto in precedenza5,8.Per le misurazioni di loganin e secologanin, ~0,1 g di polvere di radice pelosa essiccata sono stati estratti con 10 ml di etanolo:acqua (4:1, v/v) e sonicati per 30 min.Dopo la centrifugazione, il supernatante è stato evaporato sotto vuoto e il materiale residuo è stato sciolto in 2,0 mL di acqua e filtrato attraverso un filtro da 0,22 μm.L'analisi HPLC degli estratti di loganina e secologanina è stata eseguita utilizzando un rivelatore Agilent 1260 dotato di una colonna C18 a fase inversa (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) come descritto in precedenza5,8.Le condizioni di rilevazione di loganin e secologanin sono state le seguenti: fase mobile, acetonitrile:acqua (25:75, v/v);temperatura della colonna, 30 °C;e lunghezza d'onda di rilevamento, 236 nm.Gli standard disponibili in commercio di loganin e secologanin (Aladdin, Shanghai, Cina) sono stati utilizzati per la quantificazione comparativa come descritto in precedenza5,8.Per esprimere e purificare la proteina ricombinante, il frammento ORF OpWRKY2 a lunghezza intera è stato clonato nei siti BamH I e Hind III del vettore pCold-TF.I costrutti sono stati verificati mediante sequenziamento del DNA e trasformati in cellule di Escherichia coli ceppo Rosetta (DE3) per produrre proteine ​​di fusione con etichetta His.Il vettore vuoto pCold-TF senza OpWRKY2 è stato utilizzato come controllo negativo.Le colture cellulari di Rosetta trasformate utilizzate per l'espressione della proteina ricombinante HIS sono state indotte aggiungendo isopropil β-D-tiogalattopiranoside (IPTG) a una concentrazione finale di 0,1 mM a una densità ottica di circa 0,6 a 600 nm.Dopo l'induzione per 14 ore a 16 ° C, le cellule di Rosetta sono state raccolte mediante centrifugazione e purificate utilizzando agarosio Ni-NTA (acido nitrilotriacetico) (Invitrogen, USA) come descritto in precedenza16.Per studiare la capacità della proteina OpWRKY2 di legarsi alla W-box nel promotore OpTDC, è stata analizzata la regione a monte di 3090 bp del gene OpTDC.Per gli esperimenti del test di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA), le sonde del DNA sono state progettate sulla base della sequenza nativa del promotore OpTDC (da -2565 a -2552 rispetto all'ATG) contenente un singolo W-box.Oligonucleotidi complementari marcati con biotina all'estremità 5' di ciascun filamento sono stati sintetizzati e ricotti per produrre sonde a doppio filamento per EMSA.Gli EMSA sono stati eseguiti come descritto in precedenza16.Per studiare la capacità di OpWRKY2 di attivare trascrizionalmente il gene OpTDC, il promotore di 3090 bp di OpTDC è stato analizzato e clonato nel vettore pGreenII0800-LUC.I costrutti del reporter wt-pOpTDC::fLUC e mutant-pOpTDC::fLUC sono stati ottenuti inserendo il promotore nativo di OpTDC e una versione mutata nel vettore pGreenII0800-LUC per guidare l'espressione del gene della luciferasi della lucciola30.Il gene della luciferasi Renilla guidato dal promotore CaMV 35 S è stato utilizzato come controllo interno.I vettori assemblati sono stati cotrasformati con il plasmide helper pSoup19 in A. tumefaciens ceppo GV3101.Il ceppo A. tumefaciens GV3101 contenente pHB-OpWRKY2-YFP è stato utilizzato come effettore e pHB-YFP è stato utilizzato come controllo negativo.L'infiltrazione e il rilevamento sono stati eseguiti come descritto in precedenza, con lievi modifiche31.I ceppi reporter che ospitano wt-pOpTDC::fLUC o mutante-pOpTDC::fLUC sono stati mescolati con ceppi effettori che ospitano pHB-OpWRKY2-YFP o pHB-YFP con un rapporto di 1:1.Le foglie sono state raccolte dopo 48 ore e i test Dual-LUC sono stati eseguiti utilizzando il sistema di test Dual-Luciferase Reporter secondo le istruzioni del produttore (Promega, Madison, WI, USA).Sono state misurate tre repliche biologiche per trattamento.Tutti i primer utilizzati per amplificare il promotore OpTDC sono elencati nella Tabella S2.Per i saggi Y1H, il frammento ORF OpWRKY2 a lunghezza intera è stato amplificato e clonato nel plasmide effettore pB42AD.La tripla copia tandem del motivo pOpTDC wt-W-box (CTTCAGTCAAGGCC) e del motivo W-box mutante (CTTCCAttttAGGCC) sono state inserite nel plasmide reporter pLacZ tra EcoR I e Xho I. I saggi Y1H sono stati eseguiti come precedentemente descritto23,32.I plasmidi effettori e reporter sono stati cotrasformati nel ceppo di lievito EGY48a.I trasformanti sono stati coltivati ​​su terreno SD/-Ura/-Trp per 48 ore e testati su terreno SD/-Ura/-Trp con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside (X-gal) per 24 oreI plasmidi vuoti pB42AD e pLacZ sono stati cotrasformati in lievito e usati come controlli negativi.Tutti i primer utilizzati per amplificare i motivi OpWRKY2 e DNA sono elencati nella Tabella S2.Tutti gli esperimenti in questo studio sono stati condotti con almeno tre repliche biologiche.Tutti i dati sono presentati come media ± deviazione standard (DS).Per testare le differenze statisticamente significative tra i campioni di controllo e quelli trattati/le linee di radici pelose transgeniche, è stato condotto un test t di Student accoppiato a due code con una soglia di significatività di p <0,05.Le radici pelose di O. pumila hanno il potenziale per sintetizzare la camptotecina, ma l'associazione tra tempo di coltivazione e produzione di camptotecina rimane scarsamente caratterizzata.Per studiare la capacità delle radici pelose di O. pumila di produrre camptotecina in diversi stadi di crescita, ~ 0,2 g di radici pelose fresche con crescita uniforme sono stati inoculati nel mezzo liquido B5 e coltivati ​​per 60 giorni.Come mostrato in Fig. 2a, b, il colore e la biomassa delle radici pelose sono cambiati in diverse fasi di crescita nel tempo.Il colore delle radici pelose si è gradualmente intensificato, passando dal giallo al giallo scuro, e il colore del mezzo è cambiato da incolore a giallo (Fig. 2a).La biomassa delle radici pelose è gradualmente aumentata, raggiungendo un massimo di 0,89 g di peso secco a 40 giorni (Fig. 2b).a Il fenotipo di crescita delle radici pelose di O. pumila in diversi stadi di crescita (barre di scala: 1 cm).b La biomassa delle radici pelose di O. pumila in diversi stadi di crescita.Le barre di errore rappresentano la SD di tre repliche biologiche.c La produzione di camptotecina nelle radici pelose e nel mezzo liquido è stata rilevata mediante HPLC.Le barre di errore rappresentano la SD di tre repliche biologiche.d La trascrizione di cinque geni biosintetici della camptotecina in diversi stadi di crescita è stata rilevata mediante analisi qRT-PCR.Il livello di espressione trascrizionale di ciascun gene a 10 giorni è stato impostato su 1. Il gene OpActin è stato utilizzato come gene di riferimento interno.Le barre di errore rappresentano la SD di tre repliche tecniche.Poiché la camptotecina nelle radici pelose di O. pumila potrebbe essere escreta nel mezzo di coltura, abbiamo analizzato le radici pelose e il mezzo liquido separatamente mediante analisi HPLC per monitorare l'accumulo di camptotecina in O. pumila (Fig. 2c).La resa totale di camptotecina è aumentata nel tempo e ha raggiunto un massimo di 2,48 mg/flacone a 50 giorni (Fig. 2c).È interessante notare che il contenuto di camptotecina nel mezzo di coltura è aumentato durante il periodo di crescita e ha raggiunto 0,87 mg/flacone a 60 giorni.Al contrario, il contenuto di camptotecina estratta dalle radici pelose ha raggiunto il picco a 40 giorni a ~ 1,93 mg/flacone (Fig. 2c).Parallelamente alle analisi dei metaboliti, i livelli di espressione dei geni biosintetici della camptotecina (OpG10H, OpSLS, OpCPR, OpTDC e OpSTR) sono stati determinati mediante analisi qRT-PCR.Come mostrato in Fig. 2d, i livelli di trascrizione relativi di tutti i geni biosintetici della camptotecina sono aumentati nel tempo.La più alta sovraregolazione è stata rilevata per i geni di biosintesi OpTDC e OpSTR, raggiungendo i livelli massimi di espressione dopo 40 giorni (Fig. 2d).Dopo 50 giorni, i livelli di espressione relativi di OpG10H, OpSLS, OpTDC e OpSTR sono diminuiti (Fig. 2d).L'espressione del gene OpCPR ha raggiunto il picco a 50 giorni ed è leggermente diminuita nel punto temporale finale (Fig. 2d).Complessivamente, questi dati hanno suggerito che la biosintesi della camptotecina nelle radici pelose di O. pumila cambia dinamicamente nel tempo.In precedenza, è stato riportato che i WRKY TF sono coinvolti nella regolazione del metabolismo secondario nelle piante medicinali.Per studiare sistematicamente l'importanza degli OpWRKY nella regolazione positiva della biosintesi della camptotecina, è stato analizzato un set di dati disponibile del trascrittoma della radice pelosa di O. pumila per i geni di codifica del dominio WRKY espressi.Sono stati identificati trentaquattro presunti geni del fattore di trascrizione WRKY che codificano uno o due domini WRKY (Fig. 3a, b).L'analisi filogenetica basata sulle sequenze proteiche ha diviso i presunti TF OpWRKY in tre gruppi (Fig. 3a, b).Gli allineamenti proteici hanno mostrato che 8 OpWRKY sono caduti nel gruppo WRKY TF I, 22 OpWRKY nel gruppo WRKY TF II e 4 OpWRKY nel gruppo WRKY TF III (Fig. 3a).un allineamento della sequenza proteica di OpWRKYs.I domini WRKY conservati sono evidenziati in rosso;i domini del dito di zinco conservati sono evidenziati in blu.b Analisi filogenetica di OpWRKY.c I livelli di espressione di tutti i geni OpWRKY in diversi stadi di crescita sono stati rilevati mediante analisi qRT-PCR.Il livello di espressione di ciascun gene a 10 giorni è stato impostato su 1. Il gene OpActin è stato utilizzato come gene di riferimento interno.Per caratterizzare ulteriormente questi TF WRKY e comprendere meglio il loro ruolo nella biosintesi della camptotecina, i livelli di espressione relativa di tutti i presunti TF WRKY sono stati determinati mediante qRT-PCR in diversi stadi di crescita mediante qRT-PCR (Fig. 3c).Sono state osservate tendenze di espressione variabile per i geni OpWRKY TF.I livelli di espressione di un certo numero di geni OpWRKY sono aumentati nel tempo, mentre i livelli di espressione di altri sono gradualmente diminuiti.Il pattern di espressione di un solo gene OpWRKY TF, OpWRKY2, rispecchiava da vicino il pattern osservato per i geni biosintetici della camptotecina.L'espressione di OpWRKY2 è aumentata gradualmente fino a raggiungere un picco a 40 giorni, è leggermente diminuita a 50 giorni ed è scesa a un livello molto basso a 60 giorni (Fig. 3c).Presi insieme, questi risultati hanno indicato che OpWRKY2 potrebbe essere un gene candidato coinvolto nella regolazione positiva della biosintesi della camptotecina.Per studiare ulteriormente il modello di espressione di OpWRKY2, abbiamo raccolto materiali da tre diversi tessuti (radice, stelo e foglia) di piante di O. pumila di 2 mesi e abbiamo analizzato la biosintesi della camptotecina e i relativi livelli di trascrizione di OpWRKY2.In primo luogo, abbiamo studiato il contenuto di camptotecina in diversi tessuti e abbiamo scoperto che il livello di accumulo di camptotecina nelle radici, negli steli e nelle foglie di O. pumila era piuttosto alto, con il contenuto più alto osservato nelle radici (Fig. 4a).Quindi, abbiamo rilevato l'espressione del gene biosintetico della camptotecina OpTDC in diversi tessuti e abbiamo scoperto che era espresso in radici, steli e foglie e il livello di espressione era relativamente alto nelle radici (Fig. 4b).Inoltre, i livelli più alti di trascrizione di OpWRKY2 sono stati rilevati nelle foglie, livelli intermedi nelle radici e livelli bassi negli steli (Fig. 4c).Questi risultati indicano che OpWRKY2 potrebbe non solo essere coinvolto nella regolazione della biosintesi della camptotecina, ma anche regolare altri processi di crescita e sviluppo delle piante.a La produzione di camptotecina nelle radici, negli steli e nelle foglie di O. pumila è stata rilevata mediante HPLC.Le barre di errore rappresentano la SD di tre repliche biologiche.b, c I livelli di espressione di OpTDC (b) e OpWRKY2 (c) nelle radici, negli steli e nelle foglie di O. pumila sono stati misurati mediante qRT-PCR.I livelli di espressione genica nelle radici sono stati impostati su 1. d I livelli di espressione dei geni OpWRKY2 in diversi trattamenti con fitormoni sono stati rilevati mediante analisi qRT-PCR.Il livello di espressione genica a 0 h è stato impostato su 1. Il gene OpActin è stato utilizzato come gene di riferimento interno.Le barre di errore rappresentano la SD di tre repliche tecniche.e La localizzazione subcellulare di OpWRKY2.La localizzazione subcellulare di 35S::OpWRKY2-YFP e 35S::YFP nelle cellule epidermiche fogliari di N. benthamiana.Barre di scala: 20 μm.Successivamente, è stata analizzata la risposta trascrizionale di OpWRKY2 ai trattamenti con fitormoni esogeni.Le radici pelose di O. pumila di trenta giorni sono state trattate individualmente con gli ormoni vegetali SA, GA3, ABA e MeJA e i campioni sono stati prelevati dopo 0, 0,5, 1, 3, 6, 9 e 12 ore.I risultati presentati in Fig. 4d mostrano che l'applicazione di ciascun ormone ha portato a una rapida e significativa sovraregolazione dei livelli di trascrizione di OpWRKY2 (Fig. 4d).In risposta a SA e ABA, l'espressione di OpWRKY2 è aumentata di 14 volte dopo 1 ora ed è stata mantenuta a livelli elevati per almeno 3 ore.Al contrario, in risposta a GA e MeJA, l'espressione di OpWRKY2 ha raggiunto il picco entro 1 ora ed è tornata a livelli quasi basali a 3 ore.Questi risultati indicano un ruolo importante degli ormoni nella regolazione trascrizionale di OpWRKY2.Per analizzare la localizzazione subcellulare di OpWRKY2, abbiamo effettuato saggi di trasformazione transitoria nelle foglie di N. benthamiana.Come mostrato in Fig. 4e, i segnali fluorescenti OpWRKY2-reporter sono stati rilevati specificamente nel nucleo delle cellule fogliari di N. benthamiana, mentre la proteina di controllo YFP è stata distribuita in tutte le cellule (Fig. 4e).Questa localizzazione nucleare è conforme al ruolo previsto di OpWRKY2 come fattore di trascrizione.Per stabilire un ruolo per OpWRKY2 nella biosintesi della camptotecina, sono state generate linee di sovraespressione e silenziamento OpWRKY2.Per le radici pelose di O. pumila, i costrutti di sovraespressione e silenziamento ricombinanti sono stati introdotti negli steli espianti di O. pumila mediante trasformazione mediata da Agrobacterium (Fig. 5a-e).Linee di radici pelose transgeniche positive che trasportano OpWRKY2 sono state identificate mediante PCR sul DNA genomico di O. pumila utilizzando primer gene-specifici (Tabella S2).I risultati hanno mostrato che 17 su 48 radici pelose OpWRKY2-OE testate sono state trasformate con successo (tasso positivo del 35,4%) (Fig. S2).Inoltre, 15 delle 32 radici pelose candidate OpWRKY2-SRDX sono state trasformate con successo (tasso positivo del 46,9%) (Fig. S3).L'analisi dell'espressione di OpWRKY2 nelle linee OpWRKY2-OE ha mostrato un aumento da 1,03 a 36,55 volte dei livelli di trascrizione relativa rispetto al controllo di tipo selvaggio (Fig. 5f).Nelle linee di radici pelose OpWRKY2-SRDX, i livelli di trascrizione relativi di OpWRKY2 erano aumentati da 1,26 a 25,12 volte rispetto al controllo di tipo selvaggio (Fig. 5g).Sia per OpWRKY2-OE che per OpWRKY2-SRDX, sono state selezionate 4 linee con il più alto aumento di espressione per ulteriori analisi.a O. pumila espianti su terreno B5.b O. pumila steli precoltivati ​​su terreno B5.c Radici pelose differenziate dagli espianti infetti di S. miltiorrhiza.d Radici pelose monoclonali isolate.e Monocloni a radice pelosa coltivati ​​in terreno liquido B5.f, g I livelli di trascrizione relativi di OpWRKY2 nelle linee di radice pelosa transgenica OpWRKY2-OE (f) e OpWRKY2-SRDX (g) sono stati rilevati mediante qRT-PCR.Il vettore vuoto pCAMBIA2300+ è stato utilizzato come controllo.Il livello medio di espressione di OpWRKY2 nelle due linee di radici pelose di controllo è stato impostato su 1. Il gene OpActin è stato utilizzato come gene di riferimento interno.Le barre di errore rappresentano la SD di tre repliche tecniche.soc.Proc.Sci.Proc.Sci.int.Sci.Sci.Acidi nucleici res.Lett.Proc.Sci.