Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.La suddetta percentuale di manoscritti è stata respinta negli ultimi 12 mesi.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via email.Torna a Diari » Progettazione, sviluppo e terapia di farmaci » Volume 15Withanone di Withania somnifera attenua le interazioni SARS-CoV-2 RBD e Host ACE2 per salvare le patologie indotte dalle proteine ​​​​spike nel modello di pesce zebra umanizzatoAutori Balkrishna A, Pokhrel S, Singh H, Joshi M, Mulay VP, Haldar S, Varshney APubblicato 11 marzo 2021 Volume 2021:15 Pagine 1111—1133DOI https://doi.org/10.2147/DDDT.S292805Revisione tramite revisione tra pari anonima singolaEditore che ha approvato la pubblicazione: Dr Anastasios LymperopoulosEstratto video di "Efficacia antivirale del fitochimico Withanone" [ID 292805].Acharya Balkrishna,1,2 Subarna Pokhrel,1 Hoshiyar Singh,1 Monali Joshi,1 Vallabh Prakash Mulay,1 Swati Haldar,1 Anurag Varshney1,2 1Drug Discovery and Development Division, Patanjali Research Institute, Haridwar, 249405, Uttarakhand, India;2Dipartimento di Scienze Alleate e Applicate, Università di Patanjali, Haridwar, 249405, Uttarakhand, India Corrispondenza: Anurag Varshney;Swati Haldar Drug Discovery and Development Division, Patanjali Research Institute, Roorkee-Haridwar Road, Haridwar, 249405, Uttarakhand, India Tel +91-1334-244107, Ext.7458 ;+91-1334-244107, int.7481 Fax +91-1334-244805 E-mail [e-mail protetta];[protetto da posta elettronica] Scopo: SARS-CoV-2 impegna l'ACE2 umano attraverso il suo dominio di legame del recettore della proteina spike (S) (RBD) per entrare nella cellula ospite.Recenti studi computazionali hanno riportato che withanone e withaferin A, sostanze fitochimiche presenti in Withania somnifera, mirano rispettivamente alla proteasi virale principale (MPro) e alla transmembrana ospite TMPRSS2 e alla proteina correlata al glucosio 78 (GRP78), implicando il loro potenziale come inibitori dell'ingresso virale.L'assenza di un trattamento specifico contro l'infezione da SARS-CoV-2 ha incoraggiato l'esplorazione di sostanze fitochimiche come potenziali antivirali.Obiettivo: questo studio mirava all'esplorazione in silico, insieme alla convalida in vitro e in vivo dell'efficacia antivirale del fitochimico withanone.Metodi: Attraverso l'aggancio molecolare, la simulazione della dinamica molecolare (MD) e il calcolo dell'energia elettrostatica sono state studiate le interazioni biochimiche plausibili tra withanone e il complesso ACE2-RBD.Queste osservazioni in silico sono state convalidate biochimicamente da saggi basati su ELISA.L'estratto arricchito con withanone da W. somnifera è stato testato per la sua capacità di migliorare le caratteristiche patologiche clinicamente rilevanti, modellato nel pesce zebra umanizzato attraverso l'induzione della proteina spike ricombinante SARS-CoV-2 (S).Risultati: Withanone si è legato in modo efficiente all'interfaccia di interazione del complesso ACE2-RBD e lo ha destabilizzato energeticamente.La componente elettrostatica delle energie libere di legame del complesso è stata significativamente ridotta.Le due interazioni del ponte salino intrachain (K31-E35) e la coppia ionica a lungo raggio interchain (K31-E484), all'interfaccia ACE2-RBD sono state completamente abolite dal withanone, nella simulazione di 50 ns.Il test di legame in vitro ha convalidato sperimentalmente che il withanone inibiva efficacemente (IC50 = 0,33 ng/mL) l'interazione tra ACE2 e RBD, in modo dose-dipendente.Dalle foglie di W. somnifera è stato preparato un estratto arricchito con withanone, senza alcuna co-estratto con aferina A.Questo estratto arricchito è risultato essere efficiente nel migliorare le risposte patologiche simili all'uomo indotte nel pesce zebra umanizzato dalla proteina spike ricombinante SARS-CoV-2 (S).Conclusione: In conclusione, questo studio ha fornito una convalida sperimentale per una comprensione computazionale del potenziale del withanone come potente inibitore dell'ingresso del coronavirus SARS-CoV-2 nelle cellule ospiti.Parole chiave: complesso ACE2-RBD, Withania somnifera, withanone, docking e simulazione MD, ELISA, SARS-CoV-2 S-proteina, modello di zebrafish umanizzatoL'incubo del COVID-19 è iniziato con la segnalazione di un caso di polmonite di causa sconosciuta a Wuhan, in Cina, il 31 dicembre 20191 e subito dopo, nel marzo 2020, l'OMS ha dichiarato la malattia una pandemia.Secondo l'aggiornamento epidemiologico settimanale, fino al 27 dicembre 2020 il numero totale di casi COVID-19 ha superato i 79,2 milioni con un numero di decessi superiore a 1,7 milioni dall'inizio della pandemia (https://www.who.int/ pubblicazioni/m/item/aggiornamento-epidemiologico-settimanale---29-dicembre-2020).SARS-CoV-2, il coronavirus responsabile dell'epidemia di COVID-19, è un clade gemello di SARS-CoV, che ha causato la sindrome respiratoria acuta grave (SARS) nel 2002.2 Simile a SARS-CoV, questo virus sfrutta anche i recettori ACE-2 per invadere la cellula ospite, rendendo così l'obiettivo primario delle cellule epiteliali alveolari di tipo II che esprimono ACE2 di alto livello. 2.Durante l'infezione virale, l'ingresso del virus nella cellula ospite è un passaggio critico che può essere sfruttato per la terapia antivirale.5 Pertanto, il dominio di legame del recettore (RBD) è stato un obiettivo interessante per i ricercatori per abrogare l'infezione da coronavirus.I rapporti hanno suggerito che alcuni anticorpi umani hanno riconosciuto l'RBD sul dominio S1 di SARS-CoV e hanno inibito l'infezione virale bloccando il suo attaccamento all'ACE2.6,7 Tre possibili meccanismi, vale a dire, il targeting del recettore ACE2, l'RBD della proteina S e l'interazione tra ACE2 e RBD sono stati schematicamente illustrati nella Figura 1 attraverso la quale è possibile abrogare l'ingresso/infusione di SARS-CoV-2.L'obiettivo principale è quello di prendere di mira RBD o ACE2 e si pensa meno a interrompere l'interazione RBD-ACE2.Tuttavia, un approccio di emergenza per prevenire l'ingresso del virus, nel caso in cui venga persa la prima finestra di opportunità (prima che RBD possa interagire con ACE2), sarà piuttosto prezioso.Infatti, le osservazioni riportate in questo studio identificano un potenziale candidato per questo approccio contingente.Ci riferiamo alla Withania somnifera (L.) Dunal (Solanaceae), comunemente nota come Ashwagandha.È una delle piante medicinali più apprezzate dei sistemi medicinali tradizionali indiani ed è stata utilizzata in più di 100 formulazioni ayurvediche.È terapeuticamente equivalente al ginseng, in accordo con l'osservazione che piante medicinali con bioattività simile mostrano raggruppamento filogenetico.8,9 W. somnifera è usato per trattare l'infezione genitale da virus dell'herpes simplex tra le tribù africane.10 Mostra anche proprietà anti-influenzali. 11 Nel nostro studio preliminare del marzo 2020, abbiamo osservato che il withanone si lega al centro dell'interfaccia ACE2-RBD.12 Un recente studio computazionale ha previsto che il withanone può anche interagire con la proteasi principale (MPro) di SARS-CoV-2, che è responsabile della scissione della proteasi transmembrana dell'ospite serina 2 (TMPRSS2) necessaria per l'ingresso del virus nella cellula ospite.13 In uno studio di follow-up, lo stesso gruppo ha dimostrato che withanone e withaferina A possono interagire con TMPRSS2 e bloccare l'ingresso del virus nell'ospite cellula.È stato anche dimostrato che il withanone riduce la trascrizione di TMPRSS2.14 Allo stesso modo, la withaferina A, il secondo grande fitochimico con citotossicità segnalata contro le cellule tumorali che co-estrae con il withanone dalle foglie di W. somnifera, può legarsi al GRP78 come osservato in un altro studio di docking.15 GRP78 è stato segnalato per essere coinvolto nell'infezione da MERS.Il blocco di ACE2 con anticorpi solubili o RBD della proteina S virale con ACE2 solubile sono identificati come opzioni considerevoli.16–18 Nanobodies/sybodies sintetici per bloccare RBD della proteina spike (S) SARS-CoV-2 sono riportati di recente in un preprint.19 Tuttavia , tutte queste strategie prendono di mira la cellula ospite o i fattori virali in modo indipendente.Sarà più preferibile l'inibizione di una specifica interazione ospite-patogeno, ma non esiste alcun rapporto che dimostri che questa opzione sia stata ancora esplorata.Quindi, data l'efficacia antivirale riportata di W. somnifera, abbiamo valutato se il withanone può interrompere l'interazione ospite-virale.Figura 1 Meccanismi proposti per bloccare l'ingresso di SARS-CoV-2 nelle cellule ospiti. Note: Il meccanismo alla base dell'ingresso di SARS-CoV-2 nella cellula ospite è rappresentato schematicamente.Sono illustrati tre modelli proposti in cui l'infezione da COVID-19 può essere abrogata bloccando l'interazione di RBD della proteina spike (S) e ACE2.In uno degli approcci, l'interazione ACE2-RBD può essere destabilizzata da piccole molecole.Nel secondo approccio, ACE2 può essere bloccato con mimetici RBD o frammento di anticorpi a catena singola (scFv) contro ACE2.Nel terzo approccio, l'RBD della proteina S SARS-CoV-2 può essere bloccato utilizzando il dominio extracellulare ACE-2.Un dominio Fc fuso con ACE-2 faciliterebbe la circolazione prolungata del biologico (ACE2-Fc).Le osservazioni fatte in questo studio supportano la strategia per bloccare o indebolire l'interazione tra RBD e ACE2 utilizzando fitocomposti di origine naturale.Figura 1 Meccanismi proposti per bloccare l'ingresso di SARS-CoV-2 nelle cellule ospiti. Note: Il meccanismo alla base dell'ingresso di SARS-CoV-2 nella cellula ospite è rappresentato schematicamente.Sono illustrati tre modelli proposti in cui l'infezione da COVID-19 può essere abrogata bloccando l'interazione di RBD della proteina spike (S) e ACE2.In uno degli approcci, l'interazione ACE2-RBD può essere destabilizzata da piccole molecole.Nel secondo approccio, ACE2 può essere bloccato con mimetici RBD o frammento di anticorpi a catena singola (scFv) contro ACE2.Nel terzo approccio, l'RBD della proteina S SARS-CoV-2 può essere bloccato utilizzando il dominio extracellulare ACE-2.Un dominio Fc fuso con ACE-2 faciliterebbe la circolazione prolungata del biologico (ACE2-Fc).Le osservazioni fatte in questo studio supportano la strategia per bloccare o indebolire l'interazione tra RBD e ACE2 utilizzando fitocomposti di origine naturale.L'obiettivo del presente studio era di valutare il potenziale del withanone, il principale fitocomposto presente in W. somnifera come inibitore dell'interazione specifica dell'ospite-patogeno tra l'ospite ACE2 e l'RBD virale della proteina S SARS-CoV-2 e la sua efficacia in miglioramento delle patologie infiammatorie indotte dalla proteina S in un modello di pesce zebra umanizzato della malattia.Abbiamo impiegato metodi computazionali per valutare gli effetti del withanone sull'interazione tra la proteina S virale RBD e il recettore ACE2 ospite.Attraverso uno studio di interazione basato su ELISA, abbiamo osservato che in presenza di withanone acquistato commercialmente, l'interazione tra RBD e ACE2 era significativamente ridotta.A questo proposito, è pertinente menzionare che la coestrazione di withaferin A con withanone dalle foglie di W. somnifera è inevitabile.20 Withaferin A è citotossico e questa proprietà è stata esplorata per il trattamento di diversi tipi di cancro.21 Dose equivalente umana ( HED) e la dose iniziale massima raccomandata (MRSD) per la withaferina A sono state elaborate.22 Ma si vorrebbe evitarne del tutto la presenza, se possibile, in particolare quando si tratta di una grave infezione virale che rende vulnerabile il sistema immunitario.Mantenendo questo, e il nostro successivo piano per la convalida sperimentale dell'efficacia antivirale del withanone, in prospettiva abbiamo ideato un metodo per preparare estratti di foglie di W. somnifera arricchiti solo in withanone (WiNeWsE).Inoltre, l'attività antivirale di WiNeWsE è stata verificata in un modello di pesce zebra umanizzato (HZF) di SARS-CoV-2, che è stato stabilito secondo i rapporti precedenti.23-25 ​​Il trattamento con WiNeWsE è risultato efficace nel migliorare le manifestazioni comportamentali e fenotipiche caratteristiche associato all'induzione della malattia SARS-CoV-2 nel pesce zebra.Abbiamo selezionato 200 diversi fitocomposti con metodi in silico.La strategia consisteva nel trovare fitocomposti che si legano all'interfaccia del complesso RBD-ACE2 e perturbano le loro interazioni.A questo proposito, il fitocomposto di W. somnifera ha mostrato risultati promettenti.Nove withanolidi strutturalmente simili, vale a dire, 27-idrossi withanolide, 17-idrossi withaferina A, 17-idrossi-27-deossi withaferina A, withaferina A, withanolide D, 27-idrossi withanolide B, withanolide A, withanone e 27-deossiwithaferina A sono stati identificati mediante HPLC in fase inversa in estratti di radice di W. somnifera.26 Dati non pubblicati dal nostro laboratorio hanno anche mostrato una concentrazione significativa di withanolide A, withanolide B, withaferina A e withanone in alberelli di W. somnifera di 15-20 giorni.Abbiamo studiato questi composti in dettaglio dopo lo screening preliminare.Le strutture 3D di tutti i fitocomposti sono state recuperate dal database PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov).L'ultima struttura di SARS-CoV-2 RBD complessata con il recettore ACE2 (ID PDB: 6M17, risoluzione 2,9 Å) è stata recuperata dalla banca dati delle proteine ​​(http://rcsb.org).Il dominio della proteasi pulita della catena B (ACE2) e della catena E (RBD) è stato selezionato dopo la modifica su PyMol.37 La minimizzazione dell'energia è stata eseguita da 100 passaggi di discesa più ripida, seguiti da 500 passaggi di gradiente coniugato utilizzando UCSF Chimera-1.13.127 dopo l'aggiunta idrogeni.La qualità stereochimica della struttura a energia ridotta è stata verificata utilizzando VERIFY3D, ERRAT, PROCHECK e RAMPAGE (per il grafico di Ramachandran).28–31I file SDF di tutti i ligandi scaricati dal database PubChem sono stati convertiti in file PDB utilizzando Open Babel 2.4.1.32 Gli idrogeni sono stati aggiunti utilizzando UCSF Chimera-1.13.1 (Pettersen et al) e agganciati al complesso ACE2-RBD.27 C'è ancora una sfida nell'identificare un sito di legame presunto di un ligando su una proteina.Ci sono molti rapporti sul rilevamento dei siti di legame del ligando proteico, ma la loro precisione arriva solo al 50-80%.33 Si suppone che l'aggancio mirato sia migliore dell'aggancio cieco a questo riguardo.34 Il metodo più accurato è il legame dell'aggancio molecolare- metodo di ricerca del sito (MolSite) proposto da Fukunishi e Nakamura,33 che ha mostrato un'accuratezza dell'80-99% nella previsione dei siti di legame del ligando.Nel presente studio, il sito di legame del ligando nel complesso ACE2-RBD è stato determinato con il metodo MolSite.33 In breve, il complesso ACE2-RBD è stato mappato da un centro a cinque griglie (compresa l'interfaccia proteica) di dimensioni della griglia 30 × 30 × 30, ed è stato sottoposto ai calcoli di AutoDock Vina utilizzando il PyRx Virtual Screening Tool35 con parametri predefiniti.La griglia era centrata su Cα di cinque diversi amminoacidi (x=166.539, y=105.678, z=256.879; x=178.643, y=126.269, z=220.744; x=165.097, y=119.940, z=247.957; x= 150.015, y=122.092, z=213.204; x=150.015, y=122.092, z=213.204; x=130.190, y=136.848, z=221.901);quindi, il metodo ha aiutato a mappare l'intera superficie complessa.La migliore posa di legame doveva essere la posa con l'energia più bassa, ottenuta dopo il confronto delle cinque corse di aggancio indipendenti, ed era allineata con il recettore per l'analisi dell'interazione ligando-recettore utilizzando Maestro-12.4 (Schrödinger Release 2020–2: Maestro , Schrödinger, LLC, New York, NY, USA).Discovery Studio 2017 R2 Client36 e PyMol37 sono stati utilizzati per generare la grafica.Il complesso ligando-ACE2-RBD ottenuto dopo l'aggancio molecolare è stato sottoposto a simulazione MD.I sistemi di simulazione per il complesso ACE2-RBD senza o con withanone sono stati preparati utilizzando il software VMD.38 La parametrizzazione del ligando è stata eseguita con l'interfaccia web CHARMM-GUI (http://www.charmm-gui.org)39 utilizzando il campo di forza generale CHARMM. 39 La simulazione MD è stata eseguita con il campo di forza CHARMM36 utilizzando il pacchetto NAMD.40 Il complesso proteico senza o con withanone è stato solvato con molecole d'acqua TIP3P a 105 Å dalla proteina.I sistemi sono stati ionizzati e neutralizzati con 145 mM di NaCl.I sistemi contenevano 69.051 e 69.003 molecole d'acqua nel complesso proteico rispettivamente senza e con withanone.L'insieme NPT è stato utilizzato con condizioni al contorno periodiche.La pressione è stata fissata a 1,01325 bar e la temperatura a 310 K. Il metodo Ewald a maglia di particelle è stato utilizzato per valutare le interazioni di Coulomb con una dimensione della griglia di 1 Å.In tutte le simulazioni MD è stato utilizzato un intervallo di tempo di 2 fs.Inizialmente, l'acqua è stata equilibrata per 0,5 ns a 310 K dopo aver fissato la proteina e il ligando e la riduzione al minimo dell'energia di 1000 passaggi.Sono stati eseguiti mille passaggi di minimizzazione dell'energia dell'intero sistema ed è stato eseguito un ulteriore equilibramento per 5 ns a 310 K, dopo aver rilasciato la proteina e il ligando.La tiratura è stata di 50 ns.I dati della traiettoria sono stati salvati ogni 50 ps per analizzare il cambiamento nella dinamica dell'interfaccia di rilegatura ACE2-RBD.I risultati per la flessibilità sono stati analizzati tracciando i valori RMSD degli atomi della spina dorsale (C, Cα, N) rispetto alle 1000 conformazioni e l'RMSF per residuo è stato calcolato per gli atomi Cα.Per il calcolo elettrostatico, il raggruppamento della traiettoria è stato eseguito da UCSF Chimera-1.13.127 utilizzando una dimensione del passo di uno con parametri predefiniti.Abbiamo considerato la coppia ionica come un ponte salino quando i centroidi di gruppo carichi della catena laterale e almeno una coppia di atomi di azoto e ossigeno della catena laterale si trovano entro una distanza di 3,2 Å o una coppia di ioni a lungo raggio (fino a 7 Å) ed era analizzato usando VMD.38 L'energia libera elettrostatica sulla formazione di ponti salini è stata calcolata nelle traiettorie iniziali e finali complessate con il withanone.Tutti i calcoli sono stati eseguiti secondo il protocollo di Hendsch e Tidor,41 con lievi modifiche.In breve, è stato calcolato rispetto a una mutazione delle sue catene laterali a ponte salino nei loro isosteri idrofobici.Sono identici alle catene laterali dei residui carichi, con l'eccezione che le loro cariche atomiche parziali sono state impostate a zero.Gli stati di protonazione di tutti i residui carichi sono stati assegnati a pH 7,4 utilizzando il modulo ProteinPrepare in PlayMolecule (https://www.playmolecule.org).I calcoli elettrostatici continui sono stati eseguiti con il DelPhi v8.4.3.42 Sono state utilizzate le cariche atomiche parziali PARSE e i raggi atomici.43 Il raggio della sonda del solvente utilizzato era 1,4 Å.Le costanti dielettriche della proteina e del solvente erano rispettivamente 4,0 e 80,0 e la forza ionica era 0,145 M. L'equazione di Poisson-Boltzmann è stata risolta utilizzando il metodo iterativo alle differenze finite, mappando inizialmente la molecola su una griglia 3D con una dimensione della griglia di 165 e scala di uno, quindi la messa a fuoco con una dimensione della griglia di 65 e scala di quattro.DelPhi fornisce i valori energetici in unità di kT, dove k è la costante di Boltzmann e T è la temperatura assoluta, e i valori sono stati moltiplicati per 0,5922 per ottenere i risultati in kcal/mol a temperatura ambiente (25°C).La quantificazione delle interazioni elettrostatiche è importante per studiare le interazioni proteina-proteina nei sistemi biomolecolari.Abbiamo risolto l'equazione di Poisson-Boltzmann (PBE) nel modello del solvente implicito per studiare l'interazione tra il recettore ACE2 e l'RBD virale.44 La componente elettrostatica di ΔΔG, ΔΔGel ​​può essere quantificata risolvendo l'equazione di Poisson-Boltzmann (PBE) con il presupposto che non ci siano cambiamenti conformazionali al momento del legame.Abbiamo usato DelPhi v8.4.342 per calcolare la componente elettrostatica delle energie libere di legame e nelle traiettorie ottenute dopo il raggruppamento.Il termine ΔΔGel ​​si ottiene sottraendo l'energia di rete dei partner leganti da quella del complesso (manuale DelPhi).Per il calcolo sono state utilizzate dimensioni della griglia di 165, scala di uno e forza ionica di 0,145 M.Le costanti dielettriche della proteina e del solvente erano rispettivamente 4 e 80.L'effetto del withanone sull'interazione ACE2-RBD è stato valutato utilizzando il kit di screening dell'inibitore SARS-CoV-2 (ACRObiosystems, Newark, DE, USA) secondo il protocollo del produttore.In breve, i pozzetti della piastra ELISA sono stati rivestiti con la proteina S SARS-CoV-2 troncata ricombinante che esprime solo RBD.Successivamente, la proteina ACE2 umana biotinilata è stata autorizzata a legarsi all'RBD immobilizzato nei pozzetti ELISA in presenza di 47 pg/mL (10 pM)–4,7 ​​µg/mL (10 µM) e assenza di withanone reperito commercialmente (Sigma, USA) .L'efficienza del legame ACE2 con RBD è stata rilevata attraverso la streptavidina coniugata con HRP misurando l'assorbanza a 450 nm nel lettore di micropiastre EnVision (Perkin Elmer Inc, Waltham, MA, USA).L'assorbanza è stata utilizzata per calcolare l'inibizione percentuale dell'interazione ACE2-RBD, rispetto alla miscela di reazione senza withanone.La miscela di reazione trattata con un noto inibitore (fornito con il kit) è servita da controllo positivo.L'osservazione è stata rappresentata come una curva dose-risposta e IC50 calcolato utilizzando un'opzione integrata in GraphPad Prism versione 7.0.0 per Windows (GraphPad Software, San Diego, California, USA).Foglie fresche di W. somnifera sono state raccolte dal giardino di erbe medicinali del Patanjali Research Institute, Haridwar, India, lavate con acqua e polverizzate.Quindi, 100 g di questo materiale polverizzato sono stati estratti in volume 1:10 di solvente (metanolo:acqua in rapporto 80:20) e agitati tre volte a 70°C in condizioni di riflusso.Ogni estrazione è durata due ore.Gli strati estratti sono stati filtrati, riuniti e concentrati per ottenere 2,7 g di estratto idrometanolico in polvere.Per il fingerprinting compositivo dell'estratto di foglie tramite HPTLC, 500 mg del campione sono stati miscelati in 5 mL di metanolo:acqua (80:20), sonicati per 20 minuti e centrifugati.La separazione cromatografica è stata effettuata su lastre di gel di silice 60 F254 in una fase mobile contenente toluene, acetato di etile e acido formico in un rapporto 5:5:1.Le piastre sono state scansionate a 230 nm e derivatizzate in un reagente di acido solforico anisaldeide.Il contenuto di withanone nell'estratto di foglie è stato quantificato dall'equazione di regressione 234.190*X+3.043 utilizzando un intervallo di linearità da 400–1200 ng con un coefficiente di correlazione di 0,9997.I limiti di rilevamento per spot erano rispettivamente di 0,30 e 0,90 ng.Il valore Rf utilizzato per il rilevamento era 0,40.La quantificazione compositiva di questo estratto è stata effettuata mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) (Waters Corporation, USA) dotata di pompa binaria (1525), PDAD (2998) e autocampionatore (2707).Lo standard Withanone è stato acquistato da Natural Remedies Pvt.Ltd (Bangalore, India) e disciolto in metanolo per ottenere la concentrazione appropriata.Successivamente, 0,25 g di estratto di foglie di W. somnifera sono stati diluiti con 10 ml di metanolo:acqua (75:25), sonicati per 30 minuti e filtrati utilizzando un filtro di nylon da 0,45 µm prima di iniettare 10 µl di questo nella colonna.La separazione è stata ottenuta utilizzando una colonna Shodex C18-4E (5 µm, 4,6*250 mm) e l'eluizione è stata effettuata a una portata di 1,5 mL/min utilizzando un programma di gradiente definito di fasi mobili A (1 mM KH2PO4, 0,05% H3PO4 ) e B (acetonitrile).La temperatura della colonna è stata mantenuta a 27°C.La lunghezza d'onda è stata impostata a 227 nm per l'analisi.La linea cellulare epiteliale alveolare umana (A549) è stata acquistata da un repository certificato ATCC presso il National Center of Cell Science (NCCS), Pune, India.La proteina S ricombinante SARS-CoV-2 è stata ottenuta da Bioss Antibodies (Woburn, MA, USA).La colorazione H&E e PBS sono state acquistate da Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA).Gli esperimenti di Zebrafish erano in linea con gli standard dell'Institutional Animal Ethics Committee (IAEC) in conformità con le linee guida del Committee for the Purpose of Control and Supervision of Experiments (CPCSEA), India.Tutti gli esperimenti sul pesce zebra sono stati condotti secondo i protocolli approvati dalla IAEC (numero di approvazione 223/Go062062/IAEC).I pesci sono stati alloggiati con un ciclo di luce di 14 ore e 10 ore di buio in vasche da 16 L con temperatura dell'acqua mantenuta a 27±1°C e sono stati alimentati con 5 mg di mangime commerciale (TetraBit, Blacksburg, VA, USA) per grammo di peso corporeo una volta al giorno.Per lo studio sono stati selezionati pesci zebra di un anno, lunghi 25-30 mm di entrambi i sessi, del peso di 0,5 g.I criteri di selezione e la disposizione degli alloggi sono riassunti nella Tabella 1. I soggetti dello studio sono stati divisi in sette gruppi, ciascuno contenente 24 pesci, mantenuti in due covate con 12 ciascuno.Diversi gruppi insieme ai corrispondenti trattamenti somministrati sono forniti nella Tabella 2.Tabella 1 Criteri di selezione del pesce zebra e condizioni abitativeTabella 2 Gruppi sperimentali, dimensioni del gruppo e trattamenti somministratiTabella 1 Criteri di selezione del pesce zebra e condizioni abitativeTabella 2 Gruppi sperimentali, dimensioni del gruppo e trattamenti somministratiLe cellule A549, coltivate in DMEM con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina a 37°C, sono state fatte passare continuamente tre volte prima di utilizzare il terzo passaggio per il trapianto.Le cellule 1X102 in PBS sono state iniettate per via intramuscolare alla giunzione del tronco e della regione caudale, lungo la linea mediana per seminarle nel lobo posteriore della vescica natatoria.Dopo l'iniezione, i pesci sono stati trasferiti nelle rispettive grinfie e sono stati osservati per un periodo di sette giorni.La citologia della vescica natatoria è stata studiata il giorno 7 per confermare l'aderenza delle cellule A549 e l'istituzione del modello di pesce zebra umanizzato (HZF).Un gruppo di 72 HZF senza iniezione di proteina S è stato mantenuto come controllo del modello di xenotrapianto (XMC) e studiato insieme al controllo normale (NC).Il gruppo NC conteneva 72 pesci zebra ordinari selezionati secondo i criteri indicati nella tabella 1.Sette giorni dopo lo xenotrapianto, ai pesci sono state somministrate iniezioni intramuscolari nel sito dello xenotrapianto, con 2,8 µ l di 1 ng/µl di proteina S ricombinante SARS-CoV-2 in PBS utilizzando una siringa Hamilton.I pesci sono stati anestetizzati raffreddando gradualmente l'acqua a 12°C.L'anestesia è stata confermata attraverso la riduzione del movimento dell'opercolo e la mancanza di risposta al tocco da parte della pinna caudale.Dopo l'iniezione di proteina S ricombinante, il pesce zebra subisce una serie di risposte immunitarie.Durante questo periodo il pesce viene alloggiato a 27±1°C per favorire i cambiamenti fisiologici dell'immunità.Le dosi equivalenti umane traslazionali (HED) sono state ottimizzate per essere 1000 volte inferiori alla dose umana in base al peso corporeo.Le equivalenze della dose umana sono fornite nella Tabella 3. Il dosaggio orale è stato adottato in un intervallo di diluizione di 0,2, 1, 5 rispetto all'HED per un periodo di 10 giorni.Per preparare i mangimi orali infusi, una quantità nota del composto è stata miscelata con mangime per pesci del peso di 2,5 mg per pellet ed è stata estrusa in pellet uniformi.I gruppi di studio sono stati alimentati con un ciclo di 24 ore con un numero stimato di pellet per pesce.Durante la sessione di dosaggio i pesci sono stati isolati dai rispettivi gruppi di studio e alimentati individualmente nella vasca di alimentazione.I pesci di controllo sono stati nutriti con mangime per pesci non modificato e sono stati nutriti in condizioni simili a quelle dei gruppi di studio.Lo screening farmacologico è stato effettuato in due momenti di screening, dopo tre e sei giorni di trattamento per comprendere i cambiamenti fisiopatologici acuti e subacuti.Il desametasone è stato somministrato come controllo positivo.Tabella 3 Equivalenza della dose umana e dosaggio traslazionale per Zebrafish nel presente studioTabella 3 Equivalenza della dose umana e dosaggio traslazionale per Zebrafish nel presente studioEssendo un ectoterma, il pesce zebra mostra la febbre comportamentale come immunità adattativa, cioè migra nell'acqua a una temperatura corrispondente alla sua temperatura corporea.Quindi, se un pesce zebra ha una temperatura corporea più alta a causa di reazioni immunologiche, migrerà e trascorrerà più tempo in acqua a una temperatura più alta che corrisponde a quella del suo corpo.Per studiare la febbre comportamentale è stata utilizzata una vasca sperimentale con tre camere a diverse temperature (23°C, 29°C e 37°C).Le camere sono state posizionate da sinistra a destra in ordine di temperatura crescente.Il raffreddamento e il riscaldamento continui sono stati mantenuti nelle camere laterali durante il periodo di studio.I pesci delle rispettive covate di studio sono stati introdotti individualmente nella camera del gradiente di temperatura a 29°C e hanno avuto l'opportunità di scegliere la temperatura che supporta il cambiamento fisiologico.Il tempo trascorso dal pesce nella camera del gradiente di temperatura è stato calcolato per tre minuti consecutivi e le letture sono state registrate.Figura 2 Withanone si aggancia all'interfaccia del complesso ACE2-RBD e si sposta leggermente verso il centro dell'interfaccia, modulando diverse interazioni molecolari nel processo.Note: (A) Posizione iniziale e finale di withanone nel complesso ACE2-RBD (PDB ID: 6M17) e si prevede che si sposti leggermente verso il lato ACE2 del complesso, come rivelato dalla simulazione di dinamica molecolare (MD) di 50 ns.(B) La posizione iniziale del withanone (mostrato in giallo dorato a 0 ns) e il suo posizionamento finale come previsto dalla simulazione MD dopo 50 ns (mostrato in verde) è rappresentato come una vista ingrandita.(C e D) Withanone a 0 ns (C), si lega nella tasca formando tre legami H, D30, N33 e Q96 di ACE2, oltre alle interazioni di alchile e van der Waals (D).(E e F) Withanone a 50 ns, (dopo la simulazione MD) con traiettoria finale ingrandita (E) e interazioni di withanone all'interno del complesso ACE2-RBD come si vede nella traiettoria finale (F).Tutti gli atomi RMSD di withanone tra le posizioni iniziale e finale sono 2,166 Å.(G e H) Interazione del ponte salino all'interfaccia di legame di ACE2-RBD nella traiettoria finale senza withanone (G) e con withanone (H).(I) Occupazione percentuale del ponte salino e della coppia ionica a lungo raggio modulata dall'incorporazione di withanone come si vede dall'analisi delle traiettorie di simulazione.Figura 2 Withanone si aggancia all'interfaccia del complesso ACE2-RBD e si sposta leggermente verso il centro dell'interfaccia, modulando diverse interazioni molecolari nel processo.Note: (A) Posizione iniziale e finale di withanone nel complesso ACE2-RBD (PDB ID: 6M17) e si prevede che si sposti leggermente verso il lato ACE2 del complesso, come rivelato dalla simulazione di dinamica molecolare (MD) di 50 ns.(B) La posizione iniziale del withanone (mostrato in giallo dorato a 0 ns) e il suo posizionamento finale come previsto dalla simulazione MD dopo 50 ns (mostrato in verde) è rappresentato come una vista ingrandita.(C e D) Withanone a 0 ns (C), si lega nella tasca formando tre legami H, D30, N33 e Q96 di ACE2, oltre alle interazioni di alchile e van der Waals (D).(E e F) Withanone a 50 ns, (dopo la simulazione MD) con traiettoria finale ingrandita (E) e interazioni di withanone all'interno del complesso ACE2-RBD come si vede nella traiettoria finale (F).Tutti gli atomi RMSD di withanone tra le posizioni iniziale e finale sono 2,166 Å.(G e H) Interazione del ponte salino all'interfaccia di legame di ACE2-RBD nella traiettoria finale senza withanone (G) e con withanone (H).(I) Occupazione percentuale del ponte salino e della coppia ionica a lungo raggio modulata dall'incorporazione di withanone come si vede dall'analisi delle traiettorie di simulazione.L'imaging dell'intero animale è stato eseguito utilizzando una fotocamera reflex digitale a obiettivo singolo (DSLR) (D3100 Nikon Corporation, Tokyo, Giappone).Sono stati enumerati i pesci con emorragie cutanee, delimitate da macchie rosse.I pesci sono stati soppressi mettendoli in acqua a 2–4°C e sezionati secondo le linee guida etiche mediante incisione ventrale nella pelle dalla mascella inferiore allo sfiato.Il tratto intestinale e le gonadi sono stati rimossi per esporre la vescica natatoria.La vescica natatoria, situata ventrale rispetto al rene, è stata isolata senza alcun danno all'esofago ad esso collegato tramite dotto pneumatico.Allo stesso modo, sono stati rimossi cuore, cavità intestinale e gonadi per esporre il rene attaccato alla parete del corpo dorsale.Il pesce è stato bloccato sulla tavola da dissezione con il lato ventrale rivolto verso l'alto per isolare il rene intatto.La vescica natatoria e il rene isolati sono stati lavati in PBS e osservati allo stereomicroscopio Labomed CM4 con ingrandimento 1X, utilizzando una fotocamera Labomed da 14 MP.I vetrini citologici sono stati preparati da vescica natatoria intera e necropsie renali e sono stati colorati con H&E.La mortalità è stata contata su base giornaliera e tracciata come una curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier per comprendere il tasso di sopravvivenza dei gruppi di studio rispetto all'intervento terapeutico.COVID-19, malattia da coronavirus 2019;Tutti i dati generati o analizzati durante questo studio sono inclusi in questo articolo pubblicato.Questa ricerca non ha ricevuto finanziamenti esterni.Gli autori non segnalano conflitti di interesse in questo lavoro.J Med Virol.Il coronavirus correlato alla sindrome respiratoria acuta grave della specie: classificare 2019-nCoV e denominarlo SARS-CoV-2.Critico Cura.medRxiv.Adv Virus Res.Droghe.Scienza.Phytother ris.Biochimica cellulare.J Biomol Strut din.J Biomol Strut din.Bioinformazione.Anticorpo neutralizzante e inibizione solubile ACE2 di un VSV-SARS-CoV-2 competente per la replica e un isolato clinico di SARS-CoV-2.Clin Sci.Clin Sci.bioRxiv.PLoS uno.Int J Mol Sci.J Ayurveda Integr Med.Pesce zebra.Dev Comp Immunol.Analisi dei withanolidi nella radice e nella foglia di Withania somnifera mediante HPLC con array di fotodiodi e rilevamento della dispersione della luce evaporativa.Fitochim anale.2008;19(2):148–154.Natura.Sci proteicoJ Mol Biol.Sci proteicoproteine.Biologia Chimica.Metodi in Biologia Molecolare.vol.2017.Sci proteicoMol immunolo.Mol endocrinolo.Immunolo ai crostacei di pesce.Scienziato della vitaJClin Virol.Int J Mol Sci.J Biol Chem.Scienza.Biopolimeri.J Mol Biol.Struttura di Mpro da SARS-CoV-2 e scoperta dei suoi inibitori.Natura.Progettazione di inibitori ad ampio spettro mirati alle principali proteasi del coronavirus.PLoS Biol.Molecole.J Biomol Strut din.Pesce zebra.Int J Agenti antimicrobici.Questo lavoro è pubblicato e concesso in licenza da Dove Medical Press Limited.Gli usi non 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